اسینتوباکتر بومانی بهعنوان یک باکتری پاتوژن فرصت طلب مهم، عامل ایجاد عفونتهای بیمارستانی مختلفی از قبیل پنومونی، باکتریمی، عفونتهای زخمهای جراحی، مننژیت ثانویه و عفونتهای مجاری ادراری است. یکی از مشکلات موجود در مورد اسینتو باکتر ظهور سویههایی با مقاومت چند دارویی (MDR) است (1). مکانیسمهای مختلفی موجب مقاومت آنتیبیوتیکی اسینتوباکتر بومانی میشود که شامل تولیدآنزیمهای بتالاکتاماز، آنزیمهای تغییردهنده آمینوگلیکوزیدها و افزایش بیان پمپهای تراوشی (افلاکس پمپها) است. یکی از راههای مقابله با پدیده مقاومت آنتیبیوتیکی استفاده از داروهای گیاهی به جای آنتی بیوتیکها است. از جمله مزایای استفاده از داروهای گیاهی کمتر بودن عوارض جانبی و همچنین کاهش احتمال بروز مقاومت به این ترکیبات است. مطالعات زیادی اثرات درمانی و مؤثر گیاهان دارویی و مشتقات آنها را بر باکتریها بررسی کردهاند. بربرین دارای خاصیت ضدباکتریایی علیه بسیاری از باکتریها از جمله اشریشیاکلی، بروسلا آبورتوس، استافیلوکوکوس اورئوس، سودوموناس آئروزینوزا و برخی از قارچها است. بربرین بهعنوان یک مشتق گیاهی، به صورت یک آلکالوئید طبیعی است که در ریشه و ریزومهای گیاه زرشک (بربریس ولگاریس) یافت میشود و مطالعات نشان داده که دارای خواص درمانی و آنتی اکسیدانی است (2،3). مطالعات نشان داده از جمله ویژگیهای مهم این ماده خاصیت آبگریزی اجزاء تشکیل دهنده آن است که موجب نفوذ این مواد به لیپیدهای غشاء سلول باکتری و میتوکندریها میشود و در نتیجه سبب اختلال در ساختمان آنها و ایجاد نفوذپذیری بیشتر میگردد که این مساله موجب خروج و نشت یونها و دیگر محتویات سلولی به خارج از سلول میشود. با توجه به اهیمت درمان عفونتهای بیمارستانی ناشی از اسینتوباکتر بومانی، فراوانی و در دسترس بودن گیاه بربریس ولگاریس (زرشک) و مصرف خوراکی و درمانی آن و محدود بودن مطالعات در زمینه اثر بربرین بر این باکتری، هدف از این مطالعه بررسی اثر ضد باکتریایی بربرین بهعنوان یکی از مشتقات گیاه بربریس ولگاریس بر ایزولههای مقاوم به ایمیپنم و سیپروفلوکساسین اسینتوباکتر بومانی است.
جمع آوری ایزولههای بالینی
در مطالعۀ حاضر که از نوع تجربی است در مجموع 70 ایزوله بالینی اسینتوباکتربومانی از نمونههای خلط، برونکوآلولار، لاواژ و آسپیره اندوتراشیال بیماران بستری در ICU در طی 9 ماه از اردیبهشت تا دی سال 1397 از سه مرکز درمانی دانشگاه علوم پزشکی همدان (بیمارستان بعثت، بیمارستان شهید بهشتی و بیمارستان سینا) جمعآوری شد. نمونههای جمع آوری شده به آزمایشگاه میکروبشناسی دانشکدۀ پزشکی منتقل و سپس ایزولههای اسینتوباکتربومانی با استفاده از تستهای بیوشیمیایی مختلف نظیر رشد بر روی محیط مک کانکی آگار، رشد در دمای 44 درجه سلسیوس، رنگآمیزی گرم، تستهای کاتالاز، اکسیداز و اورهآز، سیمون سیترات،(KIA) Kligler̛s Iron Agar ، (OF) Oxidative/fermentativeو (SIM) Sulfide Indole Motility تشخیص داده شدند (4).
تعیین حساسیت ضد میکروبی ایزولههای اسینتوباکتربومانی در برابر بربرین
بربرین بهصورت پودر بربرین هیدروکلراید (شرکت سیگما، کشور آلمان) تهیه شد. محلول بربرین با غلظت اولیۀ یک میلیگرم بر میلیلیتر در حلال دی متیل سولفوکساید Dimethyl sulfoxide (DMSO) تهیه شد. 10 میکرولیتر از این محلول بر روی دیسکهای کاغذی بلانک تلقیح شده و سپس این دیسکها به همراه یک دیسک دیگر ( بهعنوان شاهد که فقط حاوی DMSO است) بر روی کشت تازه اسینتوباکتر بومانی با غلظت نیم مک فارلند قرار داده شد و پس از یک شبانهروز انکوباسیون تاثیر دیسکهای حاوی بربرین بهصورت تشکیل هاله عدم رشد بررسی شد (5).
تعیین میزان حساسیت به آنتیبیوتیکهای ایمیپنم و سیپروفلوکساسین
میزان حساسیت ضد میکروبی و یا مقاومت ایزولههای اسینتوباکتر بومانی به آنتی بیوتیکهای ایمیپنم (10 میکروگرم) و سیپروفلوکساسین (5 میکروگرم) تهیه شده از شرکتMast کشور انگلستان به روش دیسک دیفیوژن براساس پروتکل استاندارد Clinical & Laboratory Standards Institute) CLSI 2017 ) تعیین شد (6) .
تعیین میزان MIC بربرین و آنتیبیوتیک های ایمیپنم و سیپروفلوکساسین
حداقل غلظت مهاری (MIC)به روش میکرو براث دایلوشن درمیکروپلیت 96 خانهای براساس پروتکل استانداردCLSI; 2017 برای همۀ ایزولههای اسینتوباکتر بومانی تعیین شد (6). بدین منظور ابتدا ایزولههای باکتریایی مورد نظر، در محیط مولرهینتون براث به مدت 18-24 ساعت کشت داده و در طول موج nm625 سوسپانسیونی با جذب 08/0 تا 1 تهیه شد، سپس 10 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتریایی به 990 میکرولیتر محیط مولر هینتون براث اضافه شد. سریالهای رقت معادل µg/mL 125/0 تا µg/mL 256 از محلول بربرین، سیپروفلوکساسین و ایمیپنم درمیکروپلیتهای 96 خانهای تهیه شده و100 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری به چاهکها اضافه شد. سپس آزمایشات مشابه برای کنترل مثبت (محیط کشت حاوی باکتری و بدون آنتیبیوتیک) و کنترل منفی (محیط کشت بدون باکتری) نیز انجام شد. سپس میکروپلیتها در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. سوشهای استاندارد سودموناس آئروژینوزا ATCC 27853 و اشرشیاکلی ATCC 25922 به عنوان سوش کنترل مورد استفاده قرارگرفتند.
تجزیهوتحلیل آماری
برای تجزیهوتحلیل دادهها از نرمافزار SPSS نسخه شماره 16 (SPSS Inc., Chicago, Ill., USA) استفاده شد. و با استفاده از روش کای اسکوئر، نتایج تجزیهوتحلیل شدند. سطح معناداری آزمون 0/05 در نظر گرفته شد.
فراوانی ایزولههای بالینی اسینتوباکتربومانی
در این مطالعه از میان 249 کشت مثبت که از مجاری تنفسی بیماران بستری در بخش ICU بیمارستانهای آموزشی شهر همدان جمعآوری شد (1/28%) 70 ایزوله اسینتوباکتر بومانی جداسازی شد که بیشترین میزان جداسازی ایزولههای اسینتوباکتر بومانی از آسپیره اندوتراشیال 40 (14/57) و کمترین میزان از لاواژ برنکوالوئولار 12 (14/17%) بود.
میزان مقاومت آنتی بیوتیکی ایزولههای اسینتو باکتر بومانی به سیپروفلوکساسین و ایمیپنم
نتایج آنتی بیوگرام به روش دیسک دیفیوژن بر روی 70 ایزوله بالینی اسینتوباکتر بومانی نشان داد که میزان مقاومت آنتیبیوتیکی به سیپروفلوکساسین و ایمیپنم به ترتیب 4/97%، 7/94% است.
تعیین میزان MIC ایمیپنم و سیپروفلوکساسین ایزولههای اسینتوباکتر بومانی
حداقل غلظت مهاری (MIC) برای همه ایزولههای بالینی (70 ایزوله) در ایزولههای مقاوم به ایمیپنم و سیپروفلوکساسین به روش میکرودایلوشن براث تعیین شد. دامنۀ مقادیر MIC ایزولهها، 8 تا 28 میکروگرم بر میلیلیترتعیین شد (جدول 1). نتایج به دست آمده نشان داد که 7/94 درصد از ایزولههای بالینی نسبت به ایمیپنم مقاوم بودند. نتایج MIC نسبت به سیپروفلوکساسین نشان میدهد که دامنه مقادیرMIC سیپروفلوکساسین ایزولهها، 4 تا 32 میکروگرم بر میلیلیتربوده است و 4/97 درصد ایزوله نسبت به سیپروفلوکساسین مقاوم بودند (جدول 1).
اثر ضدباکتریایی بربرین
میزان حساسیت ایزولههای بالینی اسینتوباکتر بومانی نسبت به بربرین به روش دیسک دیفیوژن مورد بررسی قرار گرفت و میانگین هاله عدم رشد باکتری ها در اطراف دیسک بربرین حاکی از اثر ضد باکتریای بربرین بود.
میزان MIC ایمیپنم به صورت ترکیب با بربرین
حداقل غلظت مهاری ((MIC بربرین و ایمیپنم، بهتنهایی و بهصورت ترکیب با هم بر اساس پروتکل استاندارد CLSI به روش میکروبراث دایلوشن در میکروپلیتهای 96 خانه ای بر روی 70 ایزوله مقاوم به ایمیپنم انجام شد. سریالهای رقت معادل µg/mL 065/0 تاµg/mL 128 از بربرین و ایمیپنم به صورت (50% ایمیپنم و 50% بربرین) در میکروپلیتهای 96 خانهای تهیه شد. اضافه کردن بربرین به صورت ترکیب با ایمیپنم باعث شد که میزان MIC ایمیپنم در (60 %) 42 ایزوله کاهش یابد و میزان کاهش MIC بین صفر تا 2 برابر مشاهده شد (جدول 2).
میزان MIC سیپروفلوکساسین به صورت ترکیب با بربرین
حداقل غلظت مهاری ((MIC بربرین و سیپروفلوکساسین، بهتنهایی و بهصورت ترکیب با هم بر اساس پروتکل استاندارد CLSI به روش میکرودایلوشن براث در میکروپلیتهای 96 خانهای بر روی 70 ایزوله مقاوم به سیپروفلوکساسین انجام شد. سریالهای رقت معادل µg/mL 065/0 تاµg/mL 128 از بربرین و سیپروفلوکساسین به صورت (50% بربرین و 50% سیپروفلوکساسین) در میکروپلیتهای 96 خانهای تهیه شد. اضافه کردن بربرین به صورت ترکیب با سیپروفلوکساسین باعث شد که میزان MIC نسبت به سیپروفلوکساسین در 22 ایزوله (4/31%)، کاهش یابد و میزان کاهش MIC بین صفر تا 1 برابر مشاهده شد (جدول 3)
آنتیبیوتیک | 128 | 64 | 32 | 16 | 8 | 4 | 2 |
ایمیپنم | (8/22)16 | (1/17) 12 | (50) 35 | (8/2)2 | (14/7)5 | - | - |
سیپروفلوکساسین | - | - | (1/17) 12 | (2/24) 17 | (2/14) 10 | (2/44) 31 | - |
MIC ایمیپنم (میکروگرم بر میلیلیتر) | MIC بربرین |
MIC ایمیپنم+ بربرین | کاهش MIC ایمیپنم+ بربرین | فراوانی (درصد) |
8 | 5/0 | 1 | 1-0 | (15 /7) 5 |
16 | 1 | 2 | 1-0 | (85/2) 2 |
32 | 1 | 4 | 1-0 | (50)35 |
64 | 4 | 8 | 1-0 | (15/17) 12 |
128 | 8 | 16 | 2-0 | (85/22) 16 |
MIC سپیروفلوکساسین (میکروگرم/میلی لیتر) |
MIC بربرین | MIC سپیروفلوکساسین+ بربرین | کاهش MIC سپیروفلوکساسین+ بربرین | فراوانی (درصد) |
4 | 4 | 2 | 1-0 | (2/14)10 |
8 | 4 | 4 | 1-0 | (2/24)17 |
16 | 8 | 8 | 1-0 | (2/44)31 |
32 | 16 | 16 | 1-0 | (44/17)12 |
اسینتوباکتر بومانی بهعنوان یکی از مهمترین باکتریهای ایجادکننده عفونتهای بیمارستانی محسوب میشود، که توانایی ایجاد طیف وسیعی از عفونتهای بیمارستانی نظیر باکتریمی، عفونت مجاری ادراری و مننژیت ثانویه در بیماران بستری در بیمارستان را دارد (7)، ولی اهمیت زیاد این باکتری در ایجاد پنومونی بیمارستانی بهویژه پنومونی ایجاد شده در دستگاه تنفس فوقانی بیماران بستری شده در بخشهای مراقبت ویژه است (8). یکی از ویژگیهای منحصر به فرد این باکتری توانایی مقاومت ذاتی و اکتسابی نسبت به طیف گستردهای از آنتیبیوتیکهای مورد استفاده در محیط بیمارستان است، که افزایش روز افزون مقاومت داروئی نسبت به آنتیبیوتیکهای مختلف در پی داشته است. درحال حاضر شاهد حضور سویههایی از این ارگانیسم با الگوی مقاومت داروئی چندگانه (MDR)، مقاومت داروئی گسترده (XDR) و نیز مقاومت داروئی به همۀ داروها (PDR)را شاهد هستیم. این امر در حال حاضر نیز مشکلات فراوانی را برای پزشکان در درمان بیماران آلوده به این ارگانیسم های مقاوم ایجاد کرده است (9). در مطالعۀ حاضر، از میان 249 کشت مثبت که از مجاری تنفسی بیماران بستری در بخش ICU جمعآوری شد (1/28%) 70 ایزوله اسینتوباکتر بومانی جداسازی شد. که با مطالعات انجام شده قبلی مشابه بود. در این مطالعه از میان 70 ایزوله اسینتو باکتر بومانی جدا شده از مجاری تنفسی بیماران بستری در بخش ICU، (8/32%)23 ایزوله از خلط، (14/17%) 12 ایزوله از لاواژ برونکوآلوئولار و (14/57%) 40 ایزوله از آسپیره آندوتراشیال جدا شده است. در همین راستا، در مطالعهای که توسط Ebrahimi و همکاران در سال 2015 در ایران بر روی 161 کشت مثبت که از مجاری تنفسی بیماران بستری در بخش ICU جمعآوری شد شایعترین باکتری جدا شده اسینتوباکتر بومانی با 56 (35%) ایزوله گزارش شده است (10). در مطالعهای که توسط El-Saed و همکاران در سال 2013 در عربستان بر روی 457 کشت مثبت که از مجاری تنفسی بیماران بستری در بخش ICU جمعآوری شد، انجام شد شایعترین باکتری جدا شده اسینتوباکتر بومانی با 121 (5/26%) ایزوله است که این نتایج نشان میدهد شیوع اسینتوباکتر بومانی در بخش ICU بیمارستانها در حد بالایی است (11). در مطالعۀ Safari و همکاران در سال 2014 در همدان 100 ایزوله اسینتو باکتر بومانی جدا شده از مجاری تنفسی بیماران بستری در بخش ICU جمعآوری شده بود که شایعترین مکان جداسازی ایزولهها از آسپیره آندوتراشیال 74% بوده است (12). همچنین در مطالعۀVahdani و همکاران در سال 2011 تهران، 101 ایزوله اسینتوباکتر بومانی جدا شده از مجاری تنفسی بیماران بستری در بخش مراقبت های ویژه و بخش های جراحی جمعآوری شده بود، شایعترین مکان جداسازی ایزولهها از آسپیره آندوتراشیال (3/31%) بود (13). شیوع ایزولههای مقاوم اسینتوباکتر بومانی در بیشتر نقاط دنیا رو به افزایش است و این مطالعات نشان میدهد، مقاومت نه تنها به بتالاکتامها و کارباپنمها وجود دارد، همچنین به دیگر خانواده دارویی شامل آمینوگلیکوزیدها و فلوروکینولونها نیز گسترش پیدا کرده است که موجب محدودیت درمانی در این ایزولهها شده است (14). در مطالعۀ حاضر نتایج حاصل از تست مقاومت میکروبی به روش دیسک دیفیوژن و میکرودایلوشن براث نشان میدهد که مقاومت به آنتیبیوتیکهای سیپروفلوکساسین و ایمیپنم بالای 90 درصد است. بر همین اساس، در مطالعهای در ترکیه، در ایزولههای اسینتوباکتر بومانی، میزان مقاومت نسبت به پیپراسیلین، پیپراسیلین- تازوباکتام، سیپروفلوکساسین و سفتازیدیم به ترتیب 100 درصد، 4/92 درصد، 3/83 درصد و 2/74 درصد بوده است و مقاومت سطح بالایی نسبت به سایر آنتی بیوتیک ها داشتهاند (15). همسو با مطالعۀ ما در مطالعه Vazirizadeh و همکاران در بیمارستان های شهر اصفهان، میزان مقاومت آنتیبیوتیکی نسبت به سیپروفلوکساسین و ایمیپنم را به ترتیب 96 % و 98% گزارش کردند (16).
باتوجه به اهمیت بالینی باکتری اسینتو باکتر بومانی و محدود بودن مطالعات در زمینه اثر بربرین بر این باکتری، هدف از این مطالعه علاوه بر بررسی میزان مقاومت به ایمیپنم و سیپروفلوکساسین در ایزولههای اسینتوباکتر بومانی جدا شده از ICU بررسی اثر ضد باکتریایی بربرین بهعنوان یک مشتق گیاهی در دسترس بر سویههای مقاوم به ایمیپنم و سیپروفلوکساسین اسینتو باکتر بومانی بود. در مطالعۀ حاضر مشخص شد که بربرین بر باکتری اسینتو باکتر بومانی موثر بوده و باعث تشکیل هاله عدم رشد در اطراف دیسک حاوی بربرین میشود و از طرفی بربرین در ترکیب با ایمیپنم و سیپروفلوکساسین باعث کاهش میزانMIC این آنتیبیوتیکها شد. نتایج حاصل از این مطالعه نشان میدهد که اضافه کردن بربرین به صورت ترکیب با ایمیپنم باعث شد که میزان MIC نسبت به ایمیپنم در 50% ایزولهها، و نسبت به سپیروفلوکساسین در حدود 45 درصد ایزولهها کاهش یابد و میزان کاهش MIC بین صفر تا یک برابر بوده است. همچنین بر اساس نتایج حاصل از این مطالعه، بربرین به صورت ترکیب با ایمیپنم MIC را 2-0 فولد (برابر) به صورت ترکیب با سپیروفلوکساسین MIC را 1-0 فولد (برابر) کاهش داد. همسو با مطالعۀ حاضر، در سال 2017Aghayan و همکاران در تهران اثر ضد میکروبی بربرین و پالمیتین (مشتقات زرشک) را بهعنوان مهار کنندههای پمپهای ایفلاکس سیپروفلوکساسین بر روی سودوموناس آئروژینوزای جدا شده از بیماران سوختگی بررسی کردند. پس از تعیین الگوهای مقاومت آنتیبیوتیکی ایزولهها به روش دیسک دیفیوژن و همچنین حداقل غلظت مهاری (MIC)، حداقل غلظت کشنده (MBC) و همچنین اثر سینرژیستی بربرین، پالمیتین و سیپروفلوکساسین را در ایزولههای مقاوم به سیپروفلوکساسین سودوموناس آئروژینوزا به روش میکروبراث دایلوشن بررسی کردند. نتایج نشان داد که پالمیتین و بربرین میزان MIC و MBC سیپروفلوکساسین راکاهش دادهاند و تفاوت معناداری بین اثر پالمیتین و بربرین وجود ندارد (17). در مطالعهای که در سال 2003 توسط Musumeci و همکاران در ایتالیا انجام شد، اثر باکتریکشی عصارۀ متانولی گیاه زرشک (Berberis aetnensis) بر باکتری استافیلوکوکوس اورئوس بررسی شد. در این مطالعه تاثیر این عصاره را در ترکیب با سیپروفلوکساسین بر استافیلوکوکوس اورئوس به روش میکرو براث دایلوشن بررسی کردند که نتایج مطالعه نشان داد که میزان MIC در زمان استفاده از ترکیب عصاره و آنتیبیوتیک در مقایسه با استفادۀ تنها از سیپرو فلوکساسین بهطور چشمگیری کاهش داشته است و عصارۀ گیاه زرشک و آنتیبیوتیک سیپروفلوکساسین دارای اثر سینرژیستی بودند (18).
درسال 2014، Wojtyczka و همکاران در لهستان، اثر ضد میکروبی و همچنین اثر سینرژیستی بربرین و تعدادی از آنتیبیوتیکها بر گونههای استافیلوکوکوس کواگولاز منفی را به روش میکرو براث دایلوشن بررسی کردند که مشخص شد، بربرین دارای اثر ضد میکروبی چشمگیری علیه گونههای استافیلوکوکوس همولیتیکوس، استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس، کاپیتیس، گالیناریوم، هومینیس و انترمدیوس است. حداقل غلظت مهاری بربرین 16 تا 512 میکروگرم بر میلیلیتر تعیین شد. همچنین مشخص شد که بربرین دارای اثر سینرژیستی با آنتیبیوتیکهای سفوکسیتین، اریترو مایسین و لینزولاید است (19).
هم چنین در بررسیهای آنتی باکتریال بربرین، کمترین غلظتی از بربرین که باعث مهار رشد باکتریها شد در محدوده 625/0 تا 10میکروگرم بر میلیلیترتعیین شد که بیشترین فراوانی MICدر غلظت µg/ml5/2 با 56 درصد بوده است.
در این مطالعه محدودیتهایی نیز وجود داشت از جمله اینکه اسانس و عصاره گیاه مورد مطالعه نیز بایستی بررسی میشد و همچنین تاثیر این عوامل بر بیان فاکتورهای ویرولانس و ژن های مقاومتی اسینتوباکتر بومانی با روشهای مولکولی از قبیلReal-time PCR مورد ارزیابی قرار میگرفت، که با توجه به محدودیتهای شدید مالی طرحهای دانشجویی امکان دستیابی به چنین اهدافی فراهم نشد.
نتایج مطالعات مختلف که با استفاده از ماده بربرین و آنتیبیوتیکهای مخلتف بر روی باکتریهای متفاوتی انجام شد نشان داد که بربرین دارای خاصیت ضد باکتریایی است و میتواند بهعنوان یک منبع ارزان و در دسترس برای استفادۀ درمانی در برخی از عفونتهای باکتریایی مورد استفاده قرار بگیرند. به عبارتی میتوان از بربرین بهعنوان جایگزین و یا مکمل مناسب برای آنتیبیوتیکهای صناعی جهت مقابله با ایزولههای مورد آزمایش در نظر گرفت. البته، در این خصوص مطالعات بیشتری نیاز است تا بتوان اثرات ضد میکروبی بربرین را دقیقتر بررسی کرد.
یافتههای این مطالعه مشخص نمود که بربرین دارای اثرات باکتریایی در شرایط آزمایشگاهی است. مقایسه نتایج به دست آمده در این مطالعه با دیگر مطالعات نشان داد که بربرین دارای خاصیت ضد باکتریایی بوده و میتواند باعث افزایش تاثیر آنتیبیوتیکها بر باکتریهای مقاوم شود. بر این اساس، تحقیقات بر روی بربرین ارزش تحقیقی و صنعتی زیادی دارد و میتوان در آینده با بهینهسازی روشهای استفاده از بربرین برای درمان بیماریهای ناشی از عفونتهای ناشی از سویههای اسینتوباکتر بومانی استفاده نمود.
این مقاله برگرفته از یک طرح تحقیقاتی دانشجویی به شماره 9704192213 مصوب در کمیته تحقیقات دانشجویی دانشگاه علوم پزشکی همدان است. همینطور این تحقیق درکمیته اخلاق در پژوهش دانشگاه علومپزشکی همدان با شناسۀ اختصاصی IR.UMSHA.REC.1397.238 تصویب شد. نویسندگان این مقاله از معاونت پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی همدان بهدلیل حمایت مالی و همچنین از کارکنان بخش مراقبتهای ویژه بیمارستانهای بعثت، سینا و شهید بهشتی همدان کمال تشکر و قدردانی را دارند.
در انجام مطالعه حاضر، نویسندگان هیچگونه تضاد منافعی نداشتهاند.
بازنشر اطلاعات | |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |