سال 13، شماره 3 - ( مرداد - شهریور 1398 )
جلد 13 شماره 3 صفحات 209-194 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Rahimi N, Honarmand Jahromy S, Zare Karizi S. Evaluation of Antibiotic Resistance Pattern of Meropenem and Piperacillin- Tazobactam in Multi Drug Resistant Acinetobacter baumannii Isolates by Flow Cytometry Method. Iran J Med Microbiol 2019; 13 (3) :194-209
URL: http://ijmm.ir/article-1-955-fa.html
URL: http://ijmm.ir/article-1-955-fa.html
رحیمی ناهید، هنرمند جهرمی سحر، زارع کاریزی شهره. بررسی الگوی مقاومت نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و پیپراسیلین-تازوباکتام در جدایه‌های اسینتوباکتر بومانی مقاوم چند دارویی با روش فلوسایتومتری. مجله میکروب شناسی پزشکی ایران. 1398; 13 (3) :194-209
1- دانشگاه آزاد اسلامی واحد ورامین- پیشوا
2- گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد ورامین- پیشوا، ورامین، ایران ، sahar_hj2@yahoo.com
3- گروه ژنتیک، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد ورامین- پیشوا، ورامین، ایران
2- گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد ورامین- پیشوا، ورامین، ایران ، sahar_hj2@yahoo.com
3- گروه ژنتیک، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد ورامین- پیشوا، ورامین، ایران
واژه‌های کلیدی: الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی، مقاومت چندگانه دارویی، اسینتوباکتر بومانی، فلوسایتومتری
متن کامل [PDF 1041 kb]
(1944 دریافت)
| چکیده (HTML) (6245 مشاهده)
فلوسایتومتری (Flow cytometry) یا FCM دستگاهی است که سلول‌ها یا ذرات میکرومتری را از نقطه ی تماسی که اشعه لیزر روی آنها اثر میگذارد عبور داده و نوری که ذرات جذب می‌کنند بر اساس خصوصیات ذاتی یا فرعی فیزیکی خود ذره، پراکنده یا منتشر می‌شود و این نور قابل اندازه‌گیری است (1). سرعت و دقت بالای این تکنیک، موجب شد تا خیلی زود جایگاه ویژه‌ای را در رشته‌های مختلفی چون آسیب شناسی، هماتولوژی، ایمنی شناسی، ژنتیک، بررسی‌های آزمایشگاهی برای پیوند اعضاء و تشخیص بیماریهای عفونی به خود اختصاص دهد (3 ،2). با توجه به اندازه گیری چند پارامتری چندین هزار سلول منفرد در هر ثانیه توسط فلوسایتومتر، این وسیله به عنوان یک روش سریع برای آنالیز جزئیات میکروارگانیسم‌ها معرفی شده است (2). فلوسایتومتری داده‌های کمّی برای اندازه و گرانولیته سلول را از طریق پارامتر سیگنال‌های light scattering و اطلاعات کمّی سیگنال‌های فلورسنس روی سطح آنتی‌ژن‌ها یا اجزای درون‌سلولی مانند اسید‌های نوکلئیک، پروتئین‌ها یا لیپید‌ها و یا پتانسیل غشایی و جریان یون‌ها فراهم می‌سازد (2). در فلوسایتومتر، دو پارامتر
light scatter و فلورسنت، خصوصیات ریخت‌شناسی و فیزیولوژیکی سلول‌های منفرد را مشخص می‌کنند که این ویژگی‌ها با یک سیستم کامپیوتر تحلیل می‌شود (4). امروزه فلوسایتومتر ابزاری است که برای تحلیل باکتریایی از تشخیص و شمارش باکتری تا تعیین تغییرات در عملکرد سلولی و فعالیت متابولیکی و حتی شناسایی ژنهایی که تحت شرایط خاص در حالات خاصی قرار میگیرند به کار گرفته می‌شود (5). پیشرفتهای اخیر FCM همراه با نسل جدید تحقیقات سلولی، این تکنیک را برای تحلیل واکنشهای فیزیولوژیکی در باکتری‌ها مناسب ساخته است. مطالعات مختلفی به بررسی نحوه ی به‌کارگیری FCM برای تمایز شرایط فیزیولوژیکی در باکتری‌ها از جمله واکنش به آنتی‌بیوتیک‌ها و دیگر مواد شیمیایی سیتوتوکسیک و فاکتورهای فیزیکی، متابولیسم پاتوژن میزبان، تمایز سلولی در حین تشکیل بیوفیلم و مکانیسم‌های هدایت رشد و توسعه ی مسیرهایی مانند اسپورزایی پرداخته‌اند (7 ،6). کاربردهای فلوساتومتری در میکروبیولوژی از سال 1970 شناخته شده است. در این مطالعات Hutter و Paau و همکاران مقدار DNA باکتری را با پروپیدیوم یدید و پروتئین کل سلولی را با ایزوتیوسیانات فلوئورسین اندازه گیری کردند (9 ،8). سایر کاربردهای FCM در میکروبیولوژی شامل بررسی چرخه سلولی، تمایز دیواره سلولی باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی و تعیین زنده‌مانی باکتری‌ها است (10). علی‌رغم کابرد‌های وسیع فلوسایتومتری، جایگاه این تکنیک تنها در بخش‌های هماتولوژی و ایمنی‌شناسی به‌خوبی تثبیت شده است و استفاده از آن در میکروبیولوژی بالینی هنوز نادر است.
روش‌های استاندارد تست حساسیت آنتی‌بیوتیک (Antibiotic Susceptibility Test) یا AST شامل روش‌های انتشار در دیسک یا رقت در محیط مایع و روش‌های جایگزین دستی و خودکار مانند ETest و VITEK 2 هستند . بیشتر این روش‌ها حداقل غلظت آنتی‌بیوتیک را که قادر به مهار رشد گونه باکتریایی است تعیین می‌کنند (11). در نتیجه، میانگین زمان‌های لازم برای بدست آوردن یک نتیجه مناسب 18 تا 24 ساعت طول می‌کشد (12). در دو دهه گذشته، روش‌های سریعتر AST مانند تست‌های مبتنی بر اساس DNA و روش‌های مبتنی بر اسپکترومتری جرمی توسعه یافته‌اند. با این حال، این روش‌ها همیشه اطلاعات مربوط به حساسیت آنتیبیوتیکی را به خوبی ارائه نمی‌دهند. برای مثال، تست‌های مبتنی بر DNA، که اساس مولکولی داشته و بر پایه ی جهش‌های ژن‌های مقاومت هستند خیلی مناسب نیستند. علاوه بر این، باکتری‌های فاقد جهش‌های مقاومت و ژن‌های مقاومت نیز هستند که قادر به زنده ماندن در حضور درمان‌های آنتیبیوتیکی با استفاده از سایر مکانیسم‌های غیرژنتیکی هستند (13). این محدودیت در تست‌ها می‌تواند با استفاده از یک وسیله بر پایه ی شناسایی تغییرات فیزیولوژی باکتریایی ناشی از حضور آنتی‌بیوتیک‌ها و با استفاده از نشانگر‌های فلورسنت زیست‌پذیر که توسط مطالعات متعدد ثابت شده است، صورت پذیرد که همان روش فلوسایتومتری است. مزیت عمده این روش شناختی این است که برخی از تغییرات فیزیولوژیکی ناشی از آنتی‌بیوتیک‌ها مدت‌ها قبل از مهار رشد قابل مشاهده هستند (1 ساعت در برابر 1 یا 2 روز). قابلیت‌های فلوسایتومتری امکان تعیین تنوع میکروبی در کشت‌ها را فراهم کرده است. جذب غشایی و سایر شناساگر‌های زنده بودن میکروبی می‌تواند سلول به سلول سنجش شود. FCST (Flow Cytofluorometric Susceptibility Test) پاسخ‌های سلولی را در مقابل اثرات محیطی و ترکیبات مختلف می‌تواند به صورت MIC (Minimum Inhibatory Concentration) و MBC( Minimium Bactericidal concentration) مشخص کند و این مسئله آن را تبدیل به تکنیکی سریع، حساس و تکرارپذیر کرده است (14). در سال 1994، Mason و همکاران با استفاده از پتانسیل جذب رنگ دارای بار منفی dye bisdibutylbarbituric acid) trimethine oxonol1-3( تأثیر آنتی‌بیوتیک‌های آمپی‌سیلین، جنتامیسین و سیپروفلوکسازین را با فلوسایتومتر بررسی کردند (14). Suller تغییرات در یکپارچگی غشای سیتوپلاسمی به وسیله پروپیدیوم یدید و پروب آنیونیک بیس (3.1 دیبوتیل باربیتوریک اسید) تریمتین اکسونول (DiBAC4(3)) را به منظور اندازه‌گیری تغییرات در پتانسیل غشا استفاده کردند (15). در سال 2002، Gauthierو همکاران از فلوسایتومتری برای تعیین الگوی حساسیت آنتیبیوتیکی ایزوله‌های جدا شده از عفونت مجاری ادراری از روش فلوسایتومتری و رنگ فلورسنت بیس- 1 و 3 دی بوتیل باربیتوریک اسید تری متیل اگزانول (DIBAC4.(3)) استفاده کردند (16). Nuding و همکاران نیز برای تشخیص و تعیین الگوی حساسسیت آنتیبیوتیکی باکتری‌ها از فلوسایتومتری و تعیین پتانسیل غشای باکتریایی استفاده کردند (2).
در طی دهه گذشته، حضور اسینتوباکتر بومانی به‌خصوص سویههای MDR اسینتوباکتر بومانی Multiple drug resistant Acinetobacter baumannii (MDRAB) به عنوان مهم‌ترین عامل بیماری‌زا و مرگومیر بیمارستانی در سراسر دنیا شناخته شده است (17). بخشی از این رخداد، مربوط به توانایی بقای این میکروارگانیسم در محیط‌های بیمارستانی و کسب مکانیسم مقاومت و ایجاد عفونت‌های حاد، به ویژه در بیماران بدحال است به طوری که امروزه، شاهد پیدایش سویه‌هایی با مقاومت جهانی و حتی مقاوم به کولیستین بوده که درمان عفوت‌های ناشی از این باکتری را با محدودیت جدی مواجه کرده است (18). شناسایی سریع سویههای مقاوم چندگانه دارویی اسینتوباکتر بومانی در بیمارستان‌ها و مراکز درمانی در سراسر جهان کمک بزرگی به پاکسازی بخش‌های مختلف بیمارستان‌ها از وجود چنین سویه‌هایی می‌کند. هدف از مطالعه حاضر بررسی الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی ایزوله‌های اسینتوباکتر بومانی مقاوم چنددارویی نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و پیپراسیلین تازوباکتام با روش فلوسایتومتری و استفاده از رنگ رودامین 123 است.
متن کامل: (4940 مشاهده)
مقدمه
فلوسایتومتری (Flow cytometry) یا FCM دستگاهی است که سلول‌ها یا ذرات میکرومتری را از نقطه ی تماسی که اشعه لیزر روی آنها اثر میگذارد عبور داده و نوری که ذرات جذب می‌کنند بر اساس خصوصیات ذاتی یا فرعی فیزیکی خود ذره، پراکنده یا منتشر می‌شود و این نور قابل اندازه‌گیری است (1). سرعت و دقت بالای این تکنیک، موجب شد تا خیلی زود جایگاه ویژه‌ای را در رشته‌های مختلفی چون آسیب شناسی، هماتولوژی، ایمنی شناسی، ژنتیک، بررسی‌های آزمایشگاهی برای پیوند اعضاء و تشخیص بیماریهای عفونی به خود اختصاص دهد (3 ،2). با توجه به اندازه گیری چند پارامتری چندین هزار سلول منفرد در هر ثانیه توسط فلوسایتومتر، این وسیله به عنوان یک روش سریع برای آنالیز جزئیات میکروارگانیسم‌ها معرفی شده است (2). فلوسایتومتری داده‌های کمّی برای اندازه و گرانولیته سلول را از طریق پارامتر سیگنال‌های light scattering و اطلاعات کمّی سیگنال‌های فلورسنس روی سطح آنتی‌ژن‌ها یا اجزای درون‌سلولی مانند اسید‌های نوکلئیک، پروتئین‌ها یا لیپید‌ها و یا پتانسیل غشایی و جریان یون‌ها فراهم می‌سازد (2). در فلوسایتومتر، دو پارامتر
light scatter و فلورسنت، خصوصیات ریخت‌شناسی و فیزیولوژیکی سلول‌های منفرد را مشخص می‌کنند که این ویژگی‌ها با یک سیستم کامپیوتر تحلیل می‌شود (4). امروزه فلوسایتومتر ابزاری است که برای تحلیل باکتریایی از تشخیص و شمارش باکتری تا تعیین تغییرات در عملکرد سلولی و فعالیت متابولیکی و حتی شناسایی ژنهایی که تحت شرایط خاص در حالات خاصی قرار میگیرند به کار گرفته می‌شود (5). پیشرفتهای اخیر FCM همراه با نسل جدید تحقیقات سلولی، این تکنیک را برای تحلیل واکنشهای فیزیولوژیکی در باکتری‌ها مناسب ساخته است. مطالعات مختلفی به بررسی نحوه ی به‌کارگیری FCM برای تمایز شرایط فیزیولوژیکی در باکتری‌ها از جمله واکنش به آنتی‌بیوتیک‌ها و دیگر مواد شیمیایی سیتوتوکسیک و فاکتورهای فیزیکی، متابولیسم پاتوژن میزبان، تمایز سلولی در حین تشکیل بیوفیلم و مکانیسم‌های هدایت رشد و توسعه ی مسیرهایی مانند اسپورزایی پرداخته‌اند (7 ،6). کاربردهای فلوساتومتری در میکروبیولوژی از سال 1970 شناخته شده است. در این مطالعات Hutter و Paau و همکاران مقدار DNA باکتری را با پروپیدیوم یدید و پروتئین کل سلولی را با ایزوتیوسیانات فلوئورسین اندازه گیری کردند (9 ،8). سایر کاربردهای FCM در میکروبیولوژی شامل بررسی چرخه سلولی، تمایز دیواره سلولی باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی و تعیین زنده‌مانی باکتری‌ها است (10). علی‌رغم کابرد‌های وسیع فلوسایتومتری، جایگاه این تکنیک تنها در بخش‌های هماتولوژی و ایمنی‌شناسی به‌خوبی تثبیت شده است و استفاده از آن در میکروبیولوژی بالینی هنوز نادر است.
روش‌های استاندارد تست حساسیت آنتی‌بیوتیک (Antibiotic Susceptibility Test) یا AST شامل روش‌های انتشار در دیسک یا رقت در محیط مایع و روش‌های جایگزین دستی و خودکار مانند ETest و VITEK 2 هستند . بیشتر این روش‌ها حداقل غلظت آنتی‌بیوتیک را که قادر به مهار رشد گونه باکتریایی است تعیین می‌کنند (11). در نتیجه، میانگین زمان‌های لازم برای بدست آوردن یک نتیجه مناسب 18 تا 24 ساعت طول می‌کشد (12). در دو دهه گذشته، روش‌های سریعتر AST مانند تست‌های مبتنی بر اساس DNA و روش‌های مبتنی بر اسپکترومتری جرمی توسعه یافته‌اند. با این حال، این روش‌ها همیشه اطلاعات مربوط به حساسیت آنتیبیوتیکی را به خوبی ارائه نمی‌دهند. برای مثال، تست‌های مبتنی بر DNA، که اساس مولکولی داشته و بر پایه ی جهش‌های ژن‌های مقاومت هستند خیلی مناسب نیستند. علاوه بر این، باکتری‌های فاقد جهش‌های مقاومت و ژن‌های مقاومت نیز هستند که قادر به زنده ماندن در حضور درمان‌های آنتیبیوتیکی با استفاده از سایر مکانیسم‌های غیرژنتیکی هستند (13). این محدودیت در تست‌ها می‌تواند با استفاده از یک وسیله بر پایه ی شناسایی تغییرات فیزیولوژی باکتریایی ناشی از حضور آنتی‌بیوتیک‌ها و با استفاده از نشانگر‌های فلورسنت زیست‌پذیر که توسط مطالعات متعدد ثابت شده است، صورت پذیرد که همان روش فلوسایتومتری است. مزیت عمده این روش شناختی این است که برخی از تغییرات فیزیولوژیکی ناشی از آنتی‌بیوتیک‌ها مدت‌ها قبل از مهار رشد قابل مشاهده هستند (1 ساعت در برابر 1 یا 2 روز). قابلیت‌های فلوسایتومتری امکان تعیین تنوع میکروبی در کشت‌ها را فراهم کرده است. جذب غشایی و سایر شناساگر‌های زنده بودن میکروبی می‌تواند سلول به سلول سنجش شود. FCST (Flow Cytofluorometric Susceptibility Test) پاسخ‌های سلولی را در مقابل اثرات محیطی و ترکیبات مختلف می‌تواند به صورت MIC (Minimum Inhibatory Concentration) و MBC( Minimium Bactericidal concentration) مشخص کند و این مسئله آن را تبدیل به تکنیکی سریع، حساس و تکرارپذیر کرده است (14). در سال 1994، Mason و همکاران با استفاده از پتانسیل جذب رنگ دارای بار منفی dye bisdibutylbarbituric acid) trimethine oxonol1-3( تأثیر آنتی‌بیوتیک‌های آمپی‌سیلین، جنتامیسین و سیپروفلوکسازین را با فلوسایتومتر بررسی کردند (14). Suller تغییرات در یکپارچگی غشای سیتوپلاسمی به وسیله پروپیدیوم یدید و پروب آنیونیک بیس (3.1 دیبوتیل باربیتوریک اسید) تریمتین اکسونول (DiBAC4(3)) را به منظور اندازه‌گیری تغییرات در پتانسیل غشا استفاده کردند (15). در سال 2002، Gauthierو همکاران از فلوسایتومتری برای تعیین الگوی حساسیت آنتیبیوتیکی ایزوله‌های جدا شده از عفونت مجاری ادراری از روش فلوسایتومتری و رنگ فلورسنت بیس- 1 و 3 دی بوتیل باربیتوریک اسید تری متیل اگزانول (DIBAC4.(3)) استفاده کردند (16). Nuding و همکاران نیز برای تشخیص و تعیین الگوی حساسسیت آنتیبیوتیکی باکتری‌ها از فلوسایتومتری و تعیین پتانسیل غشای باکتریایی استفاده کردند (2).
در طی دهه گذشته، حضور اسینتوباکتر بومانی به‌خصوص سویههای MDR اسینتوباکتر بومانی Multiple drug resistant Acinetobacter baumannii (MDRAB) به عنوان مهم‌ترین عامل بیماری‌زا و مرگومیر بیمارستانی در سراسر دنیا شناخته شده است (17). بخشی از این رخداد، مربوط به توانایی بقای این میکروارگانیسم در محیط‌های بیمارستانی و کسب مکانیسم مقاومت و ایجاد عفونت‌های حاد، به ویژه در بیماران بدحال است به طوری که امروزه، شاهد پیدایش سویه‌هایی با مقاومت جهانی و حتی مقاوم به کولیستین بوده که درمان عفوت‌های ناشی از این باکتری را با محدودیت جدی مواجه کرده است (18). شناسایی سریع سویههای مقاوم چندگانه دارویی اسینتوباکتر بومانی در بیمارستان‌ها و مراکز درمانی در سراسر جهان کمک بزرگی به پاکسازی بخش‌های مختلف بیمارستان‌ها از وجود چنین سویه‌هایی می‌کند. هدف از مطالعه حاضر بررسی الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی ایزوله‌های اسینتوباکتر بومانی مقاوم چنددارویی نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و پیپراسیلین تازوباکتام با روش فلوسایتومتری و استفاده از رنگ رودامین 123 است.
مواد و روش‌ها
جمع‌آوری نمونه
این مطالعه مقطعی-توصیفی روی 230 نمونه بالینی شامل تراشه و زخم بیماران بستری در بخش‌های بیمارستان میلاد تهران به طور تصادفی در تاریخ آبان تا فروردین ماه 96-1395 انجام گرفت. معیار ورود بیماران به مطالعه، بستری شدن در بخش مراقبت‌های ویژه بیمارستان بود. نمونه‌گیری با رضایت بیمار و پس از تکمیل پرسشنامه انجام گرفت. کد اخلاق مربوط به نمونه‌های مورد مطالعه IR.IAU.VARAMIN .REC.1397.006 است. نمونه‌های بالینی روی محیط‌های کشت بلاد آگار و مک‌کانگی آگار، به منظور شناسایی سویههای اسینتوباکتر بومانی کشت داده شده و پس از 48-24 ساعت گرمخانه‌گذاری با رنگ‌آمیزی گرم و آزمون‌های بیوشیمیایی استاندارد مانند کاتالاز، اکسیداز، کشت در محیط‌هایTSI (شرکت مرک، آلمان)، MRVP (شرکت مرک، آلمان)، اوره (شرکت مرک، آلمان)، و تست‌های OF، لایزین، بایل اسکولین و رشد در دمای 42 درجه سلسیوس شناسایی شدند. داروها و مداخله‌گرها در این مطالعه استفاده نشد.
تست تعیین حساسیت آنتیبیوتیکی و تعیین سویههای مقاوم چنددارویی
تست تعیین حساسیت آنتیبیوتیکی (آنتی‌بیوگرام) به روش انتشار در دیسک و بر اساس استاندارد‌های CLSI 2017 نسبت به 7 آنتی‌بیوتیک با استفاده از کشت بر روی محیط مولر هینتون اگار (مرک، آلمان) انجام گرفت. دیسک‌های آنتیبیوتیکی (پادتن طب، ایران) که شامل ایمی پنم 10میکروگرم، تتراساکلین 30 میکروگرم، جنتامیسین 10 میکروگرم، سیپروفلوکسازین 5 میکروگرم، پیپراسیلین تازوباکتام 10/100 میکروگرم و مروپنم 10 میکروگرم و لووفلوکسازین 5 میکروگرم استفاده شد. نتایج آنتی‌بیوگرام ایزولهها بر اساس استاندارد CLSI2017 و با توجه به اندازه قطر هاله عدم رشد اطراف آنتی‌بیوتیک‌ها، به صورت مقاوم، نیمه‌حساس و حساس گزارش شد (جدول 1) . از سویه استاندارد اسینتوباکتر بومانی ATCC19606 به عنوان سویه کنترل کیفی استفاده شد. سویه‌هایی که به بیش از دو کلاس آنتی‌بیوتیک مقاومت نشان دادند به عنوان سویههای MDR معرفی شدند.
Table 1. Antibiotic resistance pattern of Acinetobacter baumannii isolates based on according to the CLSI 2017
تعیین حداقل غلظت مهار‌کننده رشد (minimum inhibitory concentration (MIC)) آنتی‌بیوتیک های مروپنم و پپراسیلین – تازوباکتام
برای تعیین MIC آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و پیپراسیلین، تازوباکتام (سیگما، آمریکا) تهیه شده و رقت‌های مختلف آنتی‌بیوتیک‌ها با روش براث میکرودایلوشن آماده شد. در این روش از رقت‌های 1024- 125/0 میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و پیپراسلین تازوباکتام استفاده شد. 100 میکرولیتر محیط کشت مولرهینتون براث (مرک، آلمان) به تمام چاهک‌های میکروپلیت 96 خانه افزوده شد. سپس، 100میکرولیتر از محلول آنتی‌بیوتیک مورد مطالعه به ردیف اول میکروپلیت 96 خانه اضافه شد و به صورت رقت‌های متوالی، آنتی‌بیوتیک مورد مطالعه تا اخرین ردیف رقیق گردید. جهت به دست آوردن تعداد CFU/ml106باکتری ، سوسپانسیون میکروبی معادل نیم مک فارلند به میزان 100/1، رقیق شد و 100 میکرولیتر از آن به چاهک‌ها افزوده شد (تعداد نهایی باکتری CFU/ml 05×5 است). پلیت‌ها در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت 24 ساعت، انکوبه شدند. اولین چاهکی که در آن رشدی مشاهده نشد به عنوان حداقل غلظت مهاری باکتری (MIC) تعیین گردید. علاوه بر این، برای اطمینان و جلوگیری از خطای دید در حین آزمایش 620=OD تمامی چاهک‌ها با استفاده از دستگاه الایزا ریدر )شرکت Biotek ساخت کشور آمریکا( محاسبه شد. خانه‌ای که 90 درصد کاهش در جذب نوری حاصل از رشد باکتری را نشان داد، غلظت MIC90 است. لازم به ذکر است این آزمون با سه بار تکرار انجام شد. در این آزمون به منظورکنترل محیط کشت به عنوان بلانک از محیط کشت خالی )بدون آنتی‌بیوتیک و سلول باکتری( استفاده گردید.
فلوسایتومتری و تعیین زنده بودن باکتریایی در حضور آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و پیپراسیلین تازوباکتام با رنگ‌آمیزی رودامین 123
آماده‌سازی نمونه باکتریایی برای انجام فلوسایتومتری
ابتدا سوسپانسیون نیم مک فارلند از 10 جدایه باکتری اسینتوباکتر بومانی مقاوم چند دارو و باکتری اشریشیا کلی 25922 ATCC به عنوان سویه کنترل تهیه شد. غلظت‌های مورد مطالعه آنتی‌بیوتیک مروپنم 2 و 4 و 8 میکروگرم بر میلی‌لیتر و پیپراسیلین تازوباکتام 16 و 64 و 128 میکروگرم بر میلی‌لیتر در نظر گرفته شد. برای اشریشیا کلی سویه 25922، 1 و 64 میکروگرم بر میلی‌لیتر انتخاب شدند. زمان تأثیر غلظت‌های مختلف آنتی‌بیوتیک بر سوسپانسیون باکتریایی و گرمخانه‌گذاری در دمای 37 درجه سلسیوس چهار ساعت انتخاب شد. پس از این مدت، سوسپانسیون حاوی باکتری و آنتی‌بیوتیک به لوله‌های مخصوص فلوسایتومتری منتقل شدند و به مدت 10 دقیقه با دور ×g1000 سانتریفوژ شدند. رسوب حاصله جدا شد و محلول رویی دور ریخته شد. به رسوب باقی مانده به میزان 2 میلی‌لیتر محلول 5 میلی مولار بافر فسفات PBS (Phosphate-Buffered Saline) اضافه شد و مجدداً 10 دقیقه در دور ×g1000 سانتویفوژ شدند. رسوب حاصله جدا شده و به آن 1میلی‌لیتر رنگ رودامین 123 (سیگما، آمریکا) اضافه شد. برای انجام فلوسایتومتری نمونه کنترل منفی شامل سلول‌های کشته شده از طریق جوشاندن سوسپانسیون سلولی یا استفاده از محلول هیپوکلریت سدیم به مدت 10 دقیقه بود.
آماده کردن رنگ رودامین 123 برای رنگ‌آمیزی سوسپانسیون باکتریایی
مقدار 2 میکروگرم بر میلی‌لیتر رودامین 123 در محلول (1Mm EDTA با pH=8) حل شد و محلول حاصل در ظرفی که نور به درون آن نفوذ نمی‌کرد نگهداری شد. یکی دیگر از روش‌های نگهداری رنگ رودامین 123 تهیه محلول استوک رودامین در اتانول 100درصد و ذخیره‌سازی آن در 20 درجه سلسیوس و مکانی بدون نور است . برای انجام مراحل فلوسایتومتر محلول‌های کار در ویال‌های کوچک آماده شده و در یخ قرار داده می‌شوند تا کمترین میزان تخریب در رنگ صورت گیرد.
انجام فلوسایتومتری
پس از انجام کلیه مراحل فلوسایتومتری شامل فیکس کردن نمونه‌ها و رنگ‌آمیزی باکتری‌ها با رودامین 123 آنالیز نتایج توسط دستگاه فلوسایتومتر نوع Flocytometer Face calibure (Becton Dickinson، آمریکا) به صورت بررسی میزان جذب رنگ رودامین در باکتری‌های زنده و مرده اسینتوباکتر بومانی و باکتری E.coli به عنوان شاهد، اندازه‌گیری شد. در این دستگاه اشعه لیزر هلیوم با طول موج 488 نانومتر استفاده شده است. پارامترهای به کار رفته در فلوسایتومتری شامل Forward scatter (FSC) برای تعیین اندازه سلولی با ولتاژ 360 ولت، Side Scatter (SSC) برای تعیین گرانولیته سلولی با ولتاژ 485 ولت و نور سبز فلورسنت (FL1) بود. برای تعیین میزان جذب رنگ رودامین 123 ولتاژ 600 ولت به کار برده شد. برای هر نمونه 2000 سلول در هر سنجش آنالیز شد. تحلیل داده‌ها توسط نرم‌افزار مولتی گراف (Multigraph software) که در خود دستگاه فلوسایتومتر قرار داشت انجام گرفت. اختلاف بین فلورسنت سبز و Fc از طریق Multiparameter Data Analysis Software تحلیل شد.
تحلیل آماری
از آمار توصیفی شامل فراوانی، درصد میانگین، انحراف‌معیار (Standard Deviation) برای شرح و توصیف داده‌ها استفاده شد. برای محاسبه انحراف‌معیار مقاومت‌های آنتیبیوتیکی و نتایج MIC آنتی‌بیوتیک‌ها از تست STDEV در برنامه اکسل استفاده شد. از نرم‌افزار آماری SPSSنسخه 20 (IBM-SPSS-Statistics-20-with-Fix-Pack-1-x86/x64) و برای مقایسه اعداد از آزمون کای اسکوئر استفاده شد. سطح معناداری کمتر از 05/0 در نظر گرفته شد. به منظور ارزیابی توافق بین نتایج تعیین الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و پیپراسیلین تازوباکتام با استفاده از روش‌های انتشار در دیسک، حداقل غلظت مهار‌کننده رشد یا MIC و فلوسایتومتری از روش معیار توافق یا Category Agreement (CA) استفاده شد.
تعیین حساسیت آنتیبیوتیکی سویههای اسینتوباکتربومانی
با توجه به نتایج به دست آمده (شکل 1)، میانگین مقاومت آنتیبیوتیکی سویههای اسینتوباکتر بومانی نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم، سیپروفلوکسازین، جنتامیسین، پیپراسیلین تازوباکتام، لووفلوکسازین، تتراسایکلین و ایمی پنم به ترتیب 100 درصد، 7/95 درصد، 8/72 درصد، 100 درصد، 5/98 درصد، 7/65 درصد و 2/94 درصد گزارش شد. 98 درصد جدایه‌های اسینتوباکتر بومانی به 3 کلاس آنتیبیوتیکی مقاومت نشان دادند و به عنوان سویههای MDR انتخاب شدند.
آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و پیپراسیلین تازوباکتام
بر اساس استاندارد CLSI، مقایر μg/mL8≥MIC و μg/mL128≥MIC به عنوان مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و پیپراسیلین تازوباکتام در 55 ایزوله اسینتوباکتر بومانی در نظر گرفته شد. میانگین MIC آنتی‌بیوتیک مروپنم 14/105 با انحراف‌معیار 018/84 و برای آنتی‌بیوتیک پیپراسیلین تازوباکتام 11/1236 با انحراف‌معیار 124/774 گزارش شد. 10/37 درصد سویه‌ها، برای آنتی‌بیوتیک مروپنم MIC μg/mL64 داشتند که بالاترین فراوانی را در بین ایزولهها داشت و تنها 90/2 درصد ایزولهها MIC 8 μg/mL داشتند. برای آنتی‌بیوتیک پیپراسیلین تازوباکتام بیشترین فراوانی مربوط به MIC μg/mL 1024 و بالاتر بود.
بررسی الگوی مقاومت اسینتوباکتر بومانی به آنتی‌بیوتیک مروپنم با دستگاه فلوسایتومتری
نتایج فلوسایتومتری برای جدایه اسینتوباکتر بومانی در بررسی تعداد باکتری‌های کشته شده در غلظت‌های 8 و 4 و 2 میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک مروپنم نشان داد که در غلظت 8 میکروگرم بر میلی‌لیتر که هیستوگرام جذب رنگ رودامین آن در شکل 2-الف نشان داده شده است، میزان سلول‌های کشته شده 96/1 درصد و در غلظت 4 میکروگرم بر میلی‌لیتر که هیستوگرام جذب رنگ رودامین آن در شکل 2-ب نشان داده شده است 44/1 درصد و در غلظت 2 میکروگرم بر میلی‌لیتر که هیستوگرام جذب رنگ رودامین آن در شکل 2-ج نشان داده شده 5/0 درصد است. نتایج برای 10 ایزوله اسینتوباکتر بومانی نشان داد که بیش از 98 درصد باکتری‌ها در غلظت‌های مورد مطالعه مروپنم مقاومت نشان دادند. با این حال، کاهشی جزئی در تعداد باکتری زنده با افزایش غلظت آنتی‌بیوتیک مشاهده شد.
بررسی الگوی مقاومت اسینتوباکتر بومانی به آنتی‌بیوتیک پیپراسیلین تازوبکتام با دستگاه فلوسایتومتری
نتایج فلوسایتومتری برای جدایه استینتوباکتر بومانی در بررسی تعداد باکتری‌های کشته شده در غلظت‌های 128، 64، و 16 میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک پیپراسیلین تازوباکتام نشان می‌دهد در غلظت 128میکروگرم بر میلی‌لیتر که هیستوگرام جذب رنگ رودامین شد (شکل 3-الف)، میزان سلول‌های کشته شده 8/13 درصد است؛ در غلظت 64 میکروگرم بر میلی‌لیتر که هیستوگرام جذب رنگ رودامین 123 شد (شکل 3-ب)، 3/11درصد بود؛ در غلظت 16 میکروگرم بر میلی‌لیتر که هیستوگرام جذب رنگ رودامین 123 شد (شکل 3-ج)، 9/5 درصد است؛ یعنی، بیش از 95 درصد باکتری‌ها در غلظت‌های مورد مطالعه پیپراسیلین تازوباکتام مقاومت نشان دادند. با این حال، یک کاهش تعداد باکتری زنده با افزایش غلظت آنتی‌بیوتیک مشاهده شد.
نتایج بررسی الگوی مقاومت سویه اشریشیا کلی25922 به عنوان شاهد نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و پیپراسیلین تازوباکتام با روش فلوسایتومتری
در نمودار نقطه‌ای تهیه شده از سوسپانسیون حاوی باکتری اشریشیا کلی بدون تأثیر غلظت‌های مناسب آنتی‌بیوتیک‌ها با روش فلوسایتومتری و پارامترهای FSC و SSC، میزان سلول‌های زنده 1/85 درصد مشخص شد (شکل 4-الف). نتایج فلوسایتومتری در بررسی تعداد باکتری‌های کشته شده اشریشیا کلی در غلظت‌های 1میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک مروپنم که هیستوگرام جذب رنگ رودامین شده است (شکل 4-ب)، میزان سلول‌های کشته شده را 7/96درصد نشان داد. یعنی فقط 83/2 سلول‌ها زنده ماندند. اما نتایج فلوسایتومتری در بررسی تعداد باکتری‌های کشته شده در غلظت‌های 16میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک پیپراسیلین تازوباکتام که هیستوگرام جذب رنگ رودامین رودامین شده است (شکل 4-ج)، نشان می‌دهد میزان سلول‌های کشته شده 2/96درصد است و فقط 4درصد سلول‌ها زنده ماندند.
پس از بررسی نتایج فلوسایتومتری برای تعیین الگوی حساسیت و مقاومت 10 جدایه MDR اسینتوباکتر بومانی نتایج نشان داد که بیش از 98 درصد سلول‌ها پس از تأثیر غلظت‌های مورد مطالعه مروپنم و پیپراسیلین تازوباکتام زنده ماندند و همه 10 جدایه اسینتوباکتر بومانی نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و پیپراسیلین تازوباکتام با روش فلوسایتومتری مقاومت نشان داد. مقایسه نتایج تعیین الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی با هر سه روش و بررسی معیار توافق بین روش‌ها در نهایت CA 100درصد برای هر دو آنتی‌بیوتیک گزارش شد.
در مطالعۀ حاضر اغلب سویه‌ها MIC μg/mL 64 برای آنتی‌بیوتیک مروپنم و μg/mL 1024 برای آنتی‌بیوتیک پیپراسیلین تازوباکتام داشتند که نشان از مقاومت بسیار بالای سویههای اسینتوباکتر بومانی نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های مورد مطالعه بود که با نتایج حاصل از روش انتشار در دیسک که مقاومت به آین دو آنتی‌بیوتیک را 100 درصد نشان داد همخوانی داشت. 98 درصد سویههای اسینتوباکتر بومانئی به 3 کلاس آنتیبیوتیکی مقاومت نشان دادند و به عنوان سویههای MDR انتخاب شدند. نتایج این مطالعه با یافته‌های مطالعه Karbasizade و همکاران که اعلام کردند، اکثر سویههای اسینتوباکتر بومانی جدا شده در ایران نسبت به داروهای خط اول درمان شامل آمینوگلیکوزیدها (جنتامایسین، آمیکاسین) سفتازیدیم، فلوروکینولونها (سپیروفلوکساسین) و کارباپنمها (ایمیپنم و مروپنم) مقاومت نشان میدهند، مطابقت دارد (22). در مطالعه Ardebiliو همکاران نیز مشخص شد به طورکلی 54 درصد از ایزولهها حداقل نسبت به سه کلاس آنتیبیوتیکی مقاومت مقاومت MDR نشان دادند و فراوانی مقاومت نسبت به جنتامایسین 64درصد و سپیروفلوکساسین و سفتازیدیم 88درصد میباشد که با نتایج این مطالعه مطابقت دارد (23). در ایران، مطالعات نشان داده مقاومت آنتیبیوتیکی سویههای اسینتوباکتر بومانی روزبه‌روز در حال افزایش است به طوری که در یک مطالعه سیستمیک توسط Moradi و همکاران، میزان مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و ایمی پنم که بین سال‌های 2001-2007، 3/64 درصد و 1/51 درصد بود به 5/81 درصد و 5/76درصد بین سال‌های 2013-2012 افزایش یافته است (24). در مطالعۀ Ghasemian و همکاران میزان مقاومت اسینتوباکتر بومانی به کلیستین و ایمیپنم به ترتیب 8 و 100 درصد بود (25). افزایش بیش از حد مقاومت نسبت به آنتی‌بیوتیک‌هایی مانند کارباپنمها که در این مطالعه نیز 100 درصد گزارش شد، زنگ خطر جدی برای درمان عفونت‌های مرتبط با اسینتوباکتر بومانئی است که یکی از مهم‌ترین دلایل آن انتخاب و استفاده از آنتی‌بیوتیک‌های نامناسب جهت درمان عفونت‌های باکتریایی است. درمان‌های نامناسب آنتیبیوتیکی به طور قابل توجهی منجر به افزایش هزینه‌های مراقبت‌های بهداشتی بیماران در مراکز بهداشتی‌درمانی می‌شود و نیز استفاده نامناسب از آنتی‌بیوتیک‌ها باعث کاهش عمر مفید آنها شده و نگرانی اصلی در مورد کمبود کشف آنتی‌بیوتیک‌های جدید را بیشتر می‌کند (26). آزمایش‌های سریع و دقیق تعیین حساسیت آنتیبیوتیکی باکتری‌ها می‌تواند به میزان قابل توجهی مرگومیر و هزینه‌های مالی مرتبط را کاهش دهد. علاوه بر این، ضرورت تجویز سریع یک درمان تجربی اولیه ضدمیکروبی زمانی که پزشک در انتظار کسب نتایج تست حساسیت با روش‌های استاندارد زمان‌بر است که اغلب منجر به درمان‌های نامناسب می‌شود بسیار اهمیت دارد.
در این تحقیق با روش فلوسایتومتری و با استفاده از رنگ رودامین 123 از طریق پارامترهای پراکندگی رو به جلو (Fc)، پراکندگی کناری (SS)، در غلظت‌های 2، 4 و 8 میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک مروپنم میزان سلول‌های کشته شده به ترتیب 96/1درصد، 44/1 درصد و 59/0 درصد بود. در غلظت‌های 64،128 و 16 میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک پیپراسیلین تازوباکتام میزان سلول‌های کشته شده به ترتیب 8/13درصد، 3/11درصد و 9/5 درصد بود. کاهش تعداد باکتری زنده با افزایش غلظت هر دو آنتی‌بیوتیک مشاهده شد. نتایج فلوسایتومتر برای سویه شاهد نشان داد که تعداد باکتری‌های کشته شده در غلظت‌های 1میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک مروپنم 7/96درصد است و در غلظت 16میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک پیپراسیلین میزان سلول‌های کشته شده 2/96درصد است. نتایج فلوسایتومتر طی 4 ساعت به دست آمد. رودامین 123 که یک رنگ کاتیونی لیپوفیلیک است از جمله پراب‌های فلورسنت متصل شده به غشای سلولی هستند که به عنوان ترکیباتی برای سنجش اثرات دارویی توسط فلوسایتومتر استفاده شده است. این رنگ‌ها درون سلول‌های باکتریایی بر اساس اختلاف در بار بین دو طرف غشای سلولی تجمع می‌کند (27 ،13).
Mason و همکاران با استفاده از جذب رنگ dye bisdibutylbarbituric acid) trimethine oxonol1-3( و فاکتور Fc فلوسایتومتر توانستند تأثیر آنتی‌بیوتیک‌های آمپی‌سیلین، جنتامیسین و سیپروفلوکساسن را در عرض 2 تا 5 ساعت از یک پلیت حاوی کشت باکتریایی بسته به گونه و نوع آنتی‌بیوتیک بررسی کنند. آنها گزارش دادند که این زمان بستگی به زمان لازم برای فاز پایدار در محیط مایع دارد (14). Walberg و همکاران برای سنجش حساسیت آنتی‌بیوتیک باکتری مانند مایکوباکتریا از فلوسایتومتر و جذب رنگ oxonol DiBAC4(3) استفاده کردند و نشان دادند زمانی که صرف این سنجش شد در مقایسه با روش رادیواکتیو نشان‌دار کردن کربن در محیط مایع که برای بررسی رشد مایکوباکتریا استفاده می‌شده و نیاز به صرف روز‌ها و هفته‌ها برای سنجش داشته، کمتر است (28). طی مطالعه Gauthier، 6 سویه کنترل ATCC و 41 ایزوله بالینی و جدا شده از نمونه ادرار شامل استافیلوکوکوس اورئوس، اشریشیا کلی، سودوموناس آئروجینوزا، کلبسیلا پنومونیه، پروتئوس میرابیلیس، انتروکوکوس فکالیس و استفایلوکوکس اپیدرمیتیس و ساپروفیتیکوس تحت تأثیر 12 آنتی‌بیوتیک قرار گرفتند و با روش‌های رایج تعیین الگوی حساسیت آنتیبیوتیکی و فلوسایتومتری، الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیک آنها تعیین شد. نتایج به دست آمده در روش‌های انتشار در دیسک، میکرودایلوشن براث و فلوسایتومتری 9/93درصد مطابقت داشت (16). در تحقیق حاضر بیش از 98 درصد سلول‌ها پس از تأثیر غلظت‌های مورد مطالعه مروپنم و پیپراسیلین تازوباکتام زنده ماندند و همه 10 جدایه اسینتوباکتر بومانی نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و پیپراسیلین تازوباکتام با روش فلوسایتومتری مقاومت نشان دادند. نتایج تعیین الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی با هر سه روش انتشار در دیسک، میکرودایلوشن براث و فلوسایتومتری و بررسی معیار توافق بین روش‌ها نشان داد که 100، نتایج مطابقت دارد.
Soejima و همکاران توانستند از ترکیب تیمار اتیدیوم مونو آزید (ethidium monoazide (EMA)) با FCM به عنوان روشی سریع برای تمایز بین سلول‌های زنده و آسیب‌دیده باکتری لیستریا مونوساینتوژنز تحت تأثیر آنتی‌بیوتیک استفاده کند. این روش، بسیار سریعتر از سایر روش‌های رایج در دسترس که نیاز به صرف زمان طولانی برای انجام مراحل مختلف کشت دارد انجام شد (29). طی مطالعه Saint-Ruf و همکاران، حساسیت ایزوله‌های بالینی باکتری‌های گرم منفی اشریشیا کلی و سودوموناس ائروژینوزا را با سه کلاس از آنتی‌بیوتیک‌های بتالاکتام‌ها، آمینوگلیکوزیدها و فلوروکینولونها بررسی کردند. آنها علاوه بر فلوروکروم الکسا فلور هیدرازید 633 یا AFH، از TO-PRO®-3 استفاده کردند. این رنگ‌ها وارد غشاهای آسیب‌دیده سلول‌ها شده و به DNA متصل می‌شوند. در آن مطالعه روش فلوسایتومتری روشی برای اثبات تشخیص سریع و قابل اعتماد حساسیت آنتی‌بیوتیک مناسب تشخیص داده شد (30). Huang و همکاران، واکنش باکتری‌ها را با در معرض قرار گرفتن در مقابل آنتی‌بیوتیک توسط فلوسایتومتر بررسی کردند. دو سویه حساس (اشرشیا کلی و سودوموناس ائروژینوزا) و یک سویه مقاوم چنددارویی (ایزوله بالینی اشریشیا کلی) با رنگ IR786 رنگ‌آمیزی شدند و با آنتی‌بیوتیک‌های باکتریواستاتیک برای شناسایی تغییرات وارد شده در محدوده حداقل غلظت مهاری بررسی شدند. آسیب ناشی از آنتی‌بیوتیک به وسیله جریان سایتومتری بعد از 1 ساعت انکوباسیون از طریق پراکندگی رو به جلو (Fc)(Forward Scatter) ، پراکندگی کناری (SS)(Side Scatter ) و کانال‌های فلورسنس دیده شد. اختلاف آشکاری بین اطلاعات جریان سایتومتریک از باکتری تیمارنشده با آنتی‌بیوتیک و باکتری‌های تیمارشده با آنتی‌بیوتیک مشاهده شده بود (31). Huang و همکاران مجدداً در سال 2018 توانستند الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی پاتوژن‌های مقاوم چندگانه دارویی جداشده از خون مانند اشریشیا کلی، کلبسیلا پنومونیه و اسینتوباکتر نوسوکومیالیس را طی 8 ساعت از کشت اولیه خون بیماران با روش فلوسایتومتری تعیین کنند و گزارش دادند که با کاهش چشمگیر در زمان تشخیص و تعیین الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی می‌توان نتایج معالجه درمانی بیماران را به طور چشمگیری بهبود بخشید و میزان مقاومت آنتیبیوتیکی را کاهش داد (32).
فلوسایتومتری هزینه‌های بالایی ندارد، و سایتومتر می‌تواند بسیاری از مراحل پیپت کردن و شستشو را به صورت اتوماتیک انجام دهد. درحالیکه کارکنان طی روند‌های تست حساسیت مراحل مختلفی را جهت آماده‌سازی روش به کار می‌برند. از سوی دیگر، این روش اطلاعات متفاوتی از تعداد زیادی از باکتری‌ها با تلاش کمتر و زمان کمتری به دست می‌آورد. فلوسایتومتری قادر است جمعیت‌های متنوع میکروبی در یک سوسپانسیون را آنالیز کند و تنوع میکروبی را نشان دهد. این در حالی است که با روش‌های بر پایه کشت و MIC جمعیت‌های مختلف میکروبی در کشت قابل تمایز نیستند. کوتاه کردن زمان نتایج آنتی‌بیوگرام بیماران به ویژه بیماران بستری در بخش‌های ویژه با کوتاه کردن زمان روش‌های سنجش حساسیت آنتی‌بیوتیک جهت بهبود بیماران اهمیت ویژه‌ای دارد و مسیری رو به جلو برای تأثیر بیشتر و درمان به‌موقع این بیماران به وجود می‌آورد.
این مطالعه مقطعی-توصیفی روی 230 نمونه بالینی شامل تراشه و زخم بیماران بستری در بخش‌های بیمارستان میلاد تهران به طور تصادفی در تاریخ آبان تا فروردین ماه 96-1395 انجام گرفت. معیار ورود بیماران به مطالعه، بستری شدن در بخش مراقبت‌های ویژه بیمارستان بود. نمونه‌گیری با رضایت بیمار و پس از تکمیل پرسشنامه انجام گرفت. کد اخلاق مربوط به نمونه‌های مورد مطالعه IR.IAU.VARAMIN .REC.1397.006 است. نمونه‌های بالینی روی محیط‌های کشت بلاد آگار و مک‌کانگی آگار، به منظور شناسایی سویههای اسینتوباکتر بومانی کشت داده شده و پس از 48-24 ساعت گرمخانه‌گذاری با رنگ‌آمیزی گرم و آزمون‌های بیوشیمیایی استاندارد مانند کاتالاز، اکسیداز، کشت در محیط‌هایTSI (شرکت مرک، آلمان)، MRVP (شرکت مرک، آلمان)، اوره (شرکت مرک، آلمان)، و تست‌های OF، لایزین، بایل اسکولین و رشد در دمای 42 درجه سلسیوس شناسایی شدند. داروها و مداخله‌گرها در این مطالعه استفاده نشد.
تست تعیین حساسیت آنتیبیوتیکی و تعیین سویههای مقاوم چنددارویی
تست تعیین حساسیت آنتیبیوتیکی (آنتی‌بیوگرام) به روش انتشار در دیسک و بر اساس استاندارد‌های CLSI 2017 نسبت به 7 آنتی‌بیوتیک با استفاده از کشت بر روی محیط مولر هینتون اگار (مرک، آلمان) انجام گرفت. دیسک‌های آنتیبیوتیکی (پادتن طب، ایران) که شامل ایمی پنم 10میکروگرم، تتراساکلین 30 میکروگرم، جنتامیسین 10 میکروگرم، سیپروفلوکسازین 5 میکروگرم، پیپراسیلین تازوباکتام 10/100 میکروگرم و مروپنم 10 میکروگرم و لووفلوکسازین 5 میکروگرم استفاده شد. نتایج آنتی‌بیوگرام ایزولهها بر اساس استاندارد CLSI2017 و با توجه به اندازه قطر هاله عدم رشد اطراف آنتی‌بیوتیک‌ها، به صورت مقاوم، نیمه‌حساس و حساس گزارش شد (جدول 1) . از سویه استاندارد اسینتوباکتر بومانی ATCC19606 به عنوان سویه کنترل کیفی استفاده شد. سویه‌هایی که به بیش از دو کلاس آنتی‌بیوتیک مقاومت نشان دادند به عنوان سویههای MDR معرفی شدند.
Table 1. Antibiotic resistance pattern of Acinetobacter baumannii isolates based on according to the CLSI 2017
| Antimicvobial Agent | SYMBOL | DISK ( | S | I | R |
| Meropenem (Carbapenem) | (MEN) | 10 | >23 | 20_22 | <19 |
| Ciprofloxacin(FLUOROQUINOLONES | (CP) | 5 | >21 | 2_6 | <15 |
| Gentamycin(AMINOGLYCOSIDES ) | (GM) | 10 | >15 | 13_14 | <12 |
| Piperacillin-Tazobactam(Beta lactam) | (Pip- T) | 100/1 | >21 | 18_20 | <17 |
| levofloxacin (FLUOROQUINOLONES | (LVF) | 5 | >16 | 11_15 | <10 |
| Tetracyclin (Tetracycline ) | (TE) | 30 | >15 | 12_14 | <11 |
| Imipenem (Carbapenem) | (IMP) | 10 | >18 | 14_17 | <13 |
تعیین حداقل غلظت مهار‌کننده رشد (minimum inhibitory concentration (MIC)) آنتی‌بیوتیک های مروپنم و پپراسیلین – تازوباکتام
برای تعیین MIC آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و پیپراسیلین، تازوباکتام (سیگما، آمریکا) تهیه شده و رقت‌های مختلف آنتی‌بیوتیک‌ها با روش براث میکرودایلوشن آماده شد. در این روش از رقت‌های 1024- 125/0 میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و پیپراسلین تازوباکتام استفاده شد. 100 میکرولیتر محیط کشت مولرهینتون براث (مرک، آلمان) به تمام چاهک‌های میکروپلیت 96 خانه افزوده شد. سپس، 100میکرولیتر از محلول آنتی‌بیوتیک مورد مطالعه به ردیف اول میکروپلیت 96 خانه اضافه شد و به صورت رقت‌های متوالی، آنتی‌بیوتیک مورد مطالعه تا اخرین ردیف رقیق گردید. جهت به دست آوردن تعداد CFU/ml106باکتری ، سوسپانسیون میکروبی معادل نیم مک فارلند به میزان 100/1، رقیق شد و 100 میکرولیتر از آن به چاهک‌ها افزوده شد (تعداد نهایی باکتری CFU/ml 05×5 است). پلیت‌ها در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت 24 ساعت، انکوبه شدند. اولین چاهکی که در آن رشدی مشاهده نشد به عنوان حداقل غلظت مهاری باکتری (MIC) تعیین گردید. علاوه بر این، برای اطمینان و جلوگیری از خطای دید در حین آزمایش 620=OD تمامی چاهک‌ها با استفاده از دستگاه الایزا ریدر )شرکت Biotek ساخت کشور آمریکا( محاسبه شد. خانه‌ای که 90 درصد کاهش در جذب نوری حاصل از رشد باکتری را نشان داد، غلظت MIC90 است. لازم به ذکر است این آزمون با سه بار تکرار انجام شد. در این آزمون به منظورکنترل محیط کشت به عنوان بلانک از محیط کشت خالی )بدون آنتی‌بیوتیک و سلول باکتری( استفاده گردید.
فلوسایتومتری و تعیین زنده بودن باکتریایی در حضور آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و پیپراسیلین تازوباکتام با رنگ‌آمیزی رودامین 123
آماده‌سازی نمونه باکتریایی برای انجام فلوسایتومتری
ابتدا سوسپانسیون نیم مک فارلند از 10 جدایه باکتری اسینتوباکتر بومانی مقاوم چند دارو و باکتری اشریشیا کلی 25922 ATCC به عنوان سویه کنترل تهیه شد. غلظت‌های مورد مطالعه آنتی‌بیوتیک مروپنم 2 و 4 و 8 میکروگرم بر میلی‌لیتر و پیپراسیلین تازوباکتام 16 و 64 و 128 میکروگرم بر میلی‌لیتر در نظر گرفته شد. برای اشریشیا کلی سویه 25922، 1 و 64 میکروگرم بر میلی‌لیتر انتخاب شدند. زمان تأثیر غلظت‌های مختلف آنتی‌بیوتیک بر سوسپانسیون باکتریایی و گرمخانه‌گذاری در دمای 37 درجه سلسیوس چهار ساعت انتخاب شد. پس از این مدت، سوسپانسیون حاوی باکتری و آنتی‌بیوتیک به لوله‌های مخصوص فلوسایتومتری منتقل شدند و به مدت 10 دقیقه با دور ×g1000 سانتریفوژ شدند. رسوب حاصله جدا شد و محلول رویی دور ریخته شد. به رسوب باقی مانده به میزان 2 میلی‌لیتر محلول 5 میلی مولار بافر فسفات PBS (Phosphate-Buffered Saline) اضافه شد و مجدداً 10 دقیقه در دور ×g1000 سانتویفوژ شدند. رسوب حاصله جدا شده و به آن 1میلی‌لیتر رنگ رودامین 123 (سیگما، آمریکا) اضافه شد. برای انجام فلوسایتومتری نمونه کنترل منفی شامل سلول‌های کشته شده از طریق جوشاندن سوسپانسیون سلولی یا استفاده از محلول هیپوکلریت سدیم به مدت 10 دقیقه بود.
آماده کردن رنگ رودامین 123 برای رنگ‌آمیزی سوسپانسیون باکتریایی
مقدار 2 میکروگرم بر میلی‌لیتر رودامین 123 در محلول (1Mm EDTA با pH=8) حل شد و محلول حاصل در ظرفی که نور به درون آن نفوذ نمی‌کرد نگهداری شد. یکی دیگر از روش‌های نگهداری رنگ رودامین 123 تهیه محلول استوک رودامین در اتانول 100درصد و ذخیره‌سازی آن در 20 درجه سلسیوس و مکانی بدون نور است . برای انجام مراحل فلوسایتومتر محلول‌های کار در ویال‌های کوچک آماده شده و در یخ قرار داده می‌شوند تا کمترین میزان تخریب در رنگ صورت گیرد.
انجام فلوسایتومتری
پس از انجام کلیه مراحل فلوسایتومتری شامل فیکس کردن نمونه‌ها و رنگ‌آمیزی باکتری‌ها با رودامین 123 آنالیز نتایج توسط دستگاه فلوسایتومتر نوع Flocytometer Face calibure (Becton Dickinson، آمریکا) به صورت بررسی میزان جذب رنگ رودامین در باکتری‌های زنده و مرده اسینتوباکتر بومانی و باکتری E.coli به عنوان شاهد، اندازه‌گیری شد. در این دستگاه اشعه لیزر هلیوم با طول موج 488 نانومتر استفاده شده است. پارامترهای به کار رفته در فلوسایتومتری شامل Forward scatter (FSC) برای تعیین اندازه سلولی با ولتاژ 360 ولت، Side Scatter (SSC) برای تعیین گرانولیته سلولی با ولتاژ 485 ولت و نور سبز فلورسنت (FL1) بود. برای تعیین میزان جذب رنگ رودامین 123 ولتاژ 600 ولت به کار برده شد. برای هر نمونه 2000 سلول در هر سنجش آنالیز شد. تحلیل داده‌ها توسط نرم‌افزار مولتی گراف (Multigraph software) که در خود دستگاه فلوسایتومتر قرار داشت انجام گرفت. اختلاف بین فلورسنت سبز و Fc از طریق Multiparameter Data Analysis Software تحلیل شد.
تحلیل آماری
از آمار توصیفی شامل فراوانی، درصد میانگین، انحراف‌معیار (Standard Deviation) برای شرح و توصیف داده‌ها استفاده شد. برای محاسبه انحراف‌معیار مقاومت‌های آنتیبیوتیکی و نتایج MIC آنتی‌بیوتیک‌ها از تست STDEV در برنامه اکسل استفاده شد. از نرم‌افزار آماری SPSSنسخه 20 (IBM-SPSS-Statistics-20-with-Fix-Pack-1-x86/x64) و برای مقایسه اعداد از آزمون کای اسکوئر استفاده شد. سطح معناداری کمتر از 05/0 در نظر گرفته شد. به منظور ارزیابی توافق بین نتایج تعیین الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و پیپراسیلین تازوباکتام با استفاده از روش‌های انتشار در دیسک، حداقل غلظت مهار‌کننده رشد یا MIC و فلوسایتومتری از روش معیار توافق یا Category Agreement (CA) استفاده شد.
یافته‌ها
تعداد 55 جدایه اسینتوباکتر بومانی از نمونه‌های بالینی مورد مطالعه با انجام تست‌های بیوشیمیایی جداسازی و شناسایی شدند. نتایج تست‌های بیوشیمیایی اسینتوباکتربومانی کاتالاز، اکسیداز،کشت در محیط‌هایTSI (شرکت مرک، آلمان)، MRVP (شرکت مرک، آلمان)، اوره (شرکت مرک، آلمان)، و تست‌های OF، لایزین، بایل اسکولین و رشد در دمای 42 درجه سلسیوس است.تعیین حساسیت آنتیبیوتیکی سویههای اسینتوباکتربومانی
با توجه به نتایج به دست آمده (شکل 1)، میانگین مقاومت آنتیبیوتیکی سویههای اسینتوباکتر بومانی نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم، سیپروفلوکسازین، جنتامیسین، پیپراسیلین تازوباکتام، لووفلوکسازین، تتراسایکلین و ایمی پنم به ترتیب 100 درصد، 7/95 درصد، 8/72 درصد، 100 درصد، 5/98 درصد، 7/65 درصد و 2/94 درصد گزارش شد. 98 درصد جدایه‌های اسینتوباکتر بومانی به 3 کلاس آنتیبیوتیکی مقاومت نشان دادند و به عنوان سویههای MDR انتخاب شدند.
آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و پیپراسیلین تازوباکتام
بر اساس استاندارد CLSI، مقایر μg/mL8≥MIC و μg/mL128≥MIC به عنوان مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و پیپراسیلین تازوباکتام در 55 ایزوله اسینتوباکتر بومانی در نظر گرفته شد. میانگین MIC آنتی‌بیوتیک مروپنم 14/105 با انحراف‌معیار 018/84 و برای آنتی‌بیوتیک پیپراسیلین تازوباکتام 11/1236 با انحراف‌معیار 124/774 گزارش شد. 10/37 درصد سویه‌ها، برای آنتی‌بیوتیک مروپنم MIC μg/mL64 داشتند که بالاترین فراوانی را در بین ایزولهها داشت و تنها 90/2 درصد ایزولهها MIC 8 μg/mL داشتند. برای آنتی‌بیوتیک پیپراسیلین تازوباکتام بیشترین فراوانی مربوط به MIC μg/mL 1024 و بالاتر بود.
بررسی الگوی مقاومت اسینتوباکتر بومانی به آنتی‌بیوتیک مروپنم با دستگاه فلوسایتومتری
نتایج فلوسایتومتری برای جدایه اسینتوباکتر بومانی در بررسی تعداد باکتری‌های کشته شده در غلظت‌های 8 و 4 و 2 میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک مروپنم نشان داد که در غلظت 8 میکروگرم بر میلی‌لیتر که هیستوگرام جذب رنگ رودامین آن در شکل 2-الف نشان داده شده است، میزان سلول‌های کشته شده 96/1 درصد و در غلظت 4 میکروگرم بر میلی‌لیتر که هیستوگرام جذب رنگ رودامین آن در شکل 2-ب نشان داده شده است 44/1 درصد و در غلظت 2 میکروگرم بر میلی‌لیتر که هیستوگرام جذب رنگ رودامین آن در شکل 2-ج نشان داده شده 5/0 درصد است. نتایج برای 10 ایزوله اسینتوباکتر بومانی نشان داد که بیش از 98 درصد باکتری‌ها در غلظت‌های مورد مطالعه مروپنم مقاومت نشان دادند. با این حال، کاهشی جزئی در تعداد باکتری زنده با افزایش غلظت آنتی‌بیوتیک مشاهده شد.
بررسی الگوی مقاومت اسینتوباکتر بومانی به آنتی‌بیوتیک پیپراسیلین تازوبکتام با دستگاه فلوسایتومتری
نتایج فلوسایتومتری برای جدایه استینتوباکتر بومانی در بررسی تعداد باکتری‌های کشته شده در غلظت‌های 128، 64، و 16 میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک پیپراسیلین تازوباکتام نشان می‌دهد در غلظت 128میکروگرم بر میلی‌لیتر که هیستوگرام جذب رنگ رودامین شد (شکل 3-الف)، میزان سلول‌های کشته شده 8/13 درصد است؛ در غلظت 64 میکروگرم بر میلی‌لیتر که هیستوگرام جذب رنگ رودامین 123 شد (شکل 3-ب)، 3/11درصد بود؛ در غلظت 16 میکروگرم بر میلی‌لیتر که هیستوگرام جذب رنگ رودامین 123 شد (شکل 3-ج)، 9/5 درصد است؛ یعنی، بیش از 95 درصد باکتری‌ها در غلظت‌های مورد مطالعه پیپراسیلین تازوباکتام مقاومت نشان دادند. با این حال، یک کاهش تعداد باکتری زنده با افزایش غلظت آنتی‌بیوتیک مشاهده شد.
نتایج بررسی الگوی مقاومت سویه اشریشیا کلی25922 به عنوان شاهد نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و پیپراسیلین تازوباکتام با روش فلوسایتومتری
در نمودار نقطه‌ای تهیه شده از سوسپانسیون حاوی باکتری اشریشیا کلی بدون تأثیر غلظت‌های مناسب آنتی‌بیوتیک‌ها با روش فلوسایتومتری و پارامترهای FSC و SSC، میزان سلول‌های زنده 1/85 درصد مشخص شد (شکل 4-الف). نتایج فلوسایتومتری در بررسی تعداد باکتری‌های کشته شده اشریشیا کلی در غلظت‌های 1میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک مروپنم که هیستوگرام جذب رنگ رودامین شده است (شکل 4-ب)، میزان سلول‌های کشته شده را 7/96درصد نشان داد. یعنی فقط 83/2 سلول‌ها زنده ماندند. اما نتایج فلوسایتومتری در بررسی تعداد باکتری‌های کشته شده در غلظت‌های 16میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک پیپراسیلین تازوباکتام که هیستوگرام جذب رنگ رودامین رودامین شده است (شکل 4-ج)، نشان می‌دهد میزان سلول‌های کشته شده 2/96درصد است و فقط 4درصد سلول‌ها زنده ماندند.
پس از بررسی نتایج فلوسایتومتری برای تعیین الگوی حساسیت و مقاومت 10 جدایه MDR اسینتوباکتر بومانی نتایج نشان داد که بیش از 98 درصد سلول‌ها پس از تأثیر غلظت‌های مورد مطالعه مروپنم و پیپراسیلین تازوباکتام زنده ماندند و همه 10 جدایه اسینتوباکتر بومانی نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و پیپراسیلین تازوباکتام با روش فلوسایتومتری مقاومت نشان داد. مقایسه نتایج تعیین الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی با هر سه روش و بررسی معیار توافق بین روش‌ها در نهایت CA 100درصد برای هر دو آنتی‌بیوتیک گزارش شد.
بحث
اسینتوباکتر بومانی عامل طیف وسیعی از بیماریهای عفونی است اما اغلب مجاری تنفسی، خون و زخم‌ها را درگیر می‌کند. این باکتری، سومین عامل پنومونی از طریق ونتیلاتور‌ها و نهمین عامل عفونت‌های خونی در بیمارستان‌ها است (19). وجود کاتترهای وریدی و ادراری، شدت بیماری، ماندن طولانی‌مدت در بیمارستان و نگهداری در بخش مراقبت‌های ویژه و جراحی، از مهم‌ترین فاکتورهای خطر ابتلا به عفونت‌های مرتبط با اسینتوباکتر بومانی هستند )20(. به دلیل بروز مقاومت چنددارویی (MDR) و مقاومت وسیع آنتیبیوتیکی pan drug resistance (PDR)، اغلب درمان این نوع عفونت‌ها با مشکل مواجه می‌شود و منجر به مرگ و میر بالغ بر 23درصد بیماران بستری در بیمارستان‌ها و 43درصد بیماران تحت مراقبت‌های ویژه می‌شود (21).در مطالعۀ حاضر اغلب سویه‌ها MIC μg/mL 64 برای آنتی‌بیوتیک مروپنم و μg/mL 1024 برای آنتی‌بیوتیک پیپراسیلین تازوباکتام داشتند که نشان از مقاومت بسیار بالای سویههای اسینتوباکتر بومانی نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های مورد مطالعه بود که با نتایج حاصل از روش انتشار در دیسک که مقاومت به آین دو آنتی‌بیوتیک را 100 درصد نشان داد همخوانی داشت. 98 درصد سویههای اسینتوباکتر بومانئی به 3 کلاس آنتیبیوتیکی مقاومت نشان دادند و به عنوان سویههای MDR انتخاب شدند. نتایج این مطالعه با یافته‌های مطالعه Karbasizade و همکاران که اعلام کردند، اکثر سویههای اسینتوباکتر بومانی جدا شده در ایران نسبت به داروهای خط اول درمان شامل آمینوگلیکوزیدها (جنتامایسین، آمیکاسین) سفتازیدیم، فلوروکینولونها (سپیروفلوکساسین) و کارباپنمها (ایمیپنم و مروپنم) مقاومت نشان میدهند، مطابقت دارد (22). در مطالعه Ardebiliو همکاران نیز مشخص شد به طورکلی 54 درصد از ایزولهها حداقل نسبت به سه کلاس آنتیبیوتیکی مقاومت مقاومت MDR نشان دادند و فراوانی مقاومت نسبت به جنتامایسین 64درصد و سپیروفلوکساسین و سفتازیدیم 88درصد میباشد که با نتایج این مطالعه مطابقت دارد (23). در ایران، مطالعات نشان داده مقاومت آنتیبیوتیکی سویههای اسینتوباکتر بومانی روزبه‌روز در حال افزایش است به طوری که در یک مطالعه سیستمیک توسط Moradi و همکاران، میزان مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و ایمی پنم که بین سال‌های 2001-2007، 3/64 درصد و 1/51 درصد بود به 5/81 درصد و 5/76درصد بین سال‌های 2013-2012 افزایش یافته است (24). در مطالعۀ Ghasemian و همکاران میزان مقاومت اسینتوباکتر بومانی به کلیستین و ایمیپنم به ترتیب 8 و 100 درصد بود (25). افزایش بیش از حد مقاومت نسبت به آنتی‌بیوتیک‌هایی مانند کارباپنمها که در این مطالعه نیز 100 درصد گزارش شد، زنگ خطر جدی برای درمان عفونت‌های مرتبط با اسینتوباکتر بومانئی است که یکی از مهم‌ترین دلایل آن انتخاب و استفاده از آنتی‌بیوتیک‌های نامناسب جهت درمان عفونت‌های باکتریایی است. درمان‌های نامناسب آنتیبیوتیکی به طور قابل توجهی منجر به افزایش هزینه‌های مراقبت‌های بهداشتی بیماران در مراکز بهداشتی‌درمانی می‌شود و نیز استفاده نامناسب از آنتی‌بیوتیک‌ها باعث کاهش عمر مفید آنها شده و نگرانی اصلی در مورد کمبود کشف آنتی‌بیوتیک‌های جدید را بیشتر می‌کند (26). آزمایش‌های سریع و دقیق تعیین حساسیت آنتیبیوتیکی باکتری‌ها می‌تواند به میزان قابل توجهی مرگومیر و هزینه‌های مالی مرتبط را کاهش دهد. علاوه بر این، ضرورت تجویز سریع یک درمان تجربی اولیه ضدمیکروبی زمانی که پزشک در انتظار کسب نتایج تست حساسیت با روش‌های استاندارد زمان‌بر است که اغلب منجر به درمان‌های نامناسب می‌شود بسیار اهمیت دارد.
در این تحقیق با روش فلوسایتومتری و با استفاده از رنگ رودامین 123 از طریق پارامترهای پراکندگی رو به جلو (Fc)، پراکندگی کناری (SS)، در غلظت‌های 2، 4 و 8 میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک مروپنم میزان سلول‌های کشته شده به ترتیب 96/1درصد، 44/1 درصد و 59/0 درصد بود. در غلظت‌های 64،128 و 16 میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک پیپراسیلین تازوباکتام میزان سلول‌های کشته شده به ترتیب 8/13درصد، 3/11درصد و 9/5 درصد بود. کاهش تعداد باکتری زنده با افزایش غلظت هر دو آنتی‌بیوتیک مشاهده شد. نتایج فلوسایتومتر برای سویه شاهد نشان داد که تعداد باکتری‌های کشته شده در غلظت‌های 1میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک مروپنم 7/96درصد است و در غلظت 16میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک پیپراسیلین میزان سلول‌های کشته شده 2/96درصد است. نتایج فلوسایتومتر طی 4 ساعت به دست آمد. رودامین 123 که یک رنگ کاتیونی لیپوفیلیک است از جمله پراب‌های فلورسنت متصل شده به غشای سلولی هستند که به عنوان ترکیباتی برای سنجش اثرات دارویی توسط فلوسایتومتر استفاده شده است. این رنگ‌ها درون سلول‌های باکتریایی بر اساس اختلاف در بار بین دو طرف غشای سلولی تجمع می‌کند (27 ،13).
Mason و همکاران با استفاده از جذب رنگ dye bisdibutylbarbituric acid) trimethine oxonol1-3( و فاکتور Fc فلوسایتومتر توانستند تأثیر آنتی‌بیوتیک‌های آمپی‌سیلین، جنتامیسین و سیپروفلوکساسن را در عرض 2 تا 5 ساعت از یک پلیت حاوی کشت باکتریایی بسته به گونه و نوع آنتی‌بیوتیک بررسی کنند. آنها گزارش دادند که این زمان بستگی به زمان لازم برای فاز پایدار در محیط مایع دارد (14). Walberg و همکاران برای سنجش حساسیت آنتی‌بیوتیک باکتری مانند مایکوباکتریا از فلوسایتومتر و جذب رنگ oxonol DiBAC4(3) استفاده کردند و نشان دادند زمانی که صرف این سنجش شد در مقایسه با روش رادیواکتیو نشان‌دار کردن کربن در محیط مایع که برای بررسی رشد مایکوباکتریا استفاده می‌شده و نیاز به صرف روز‌ها و هفته‌ها برای سنجش داشته، کمتر است (28). طی مطالعه Gauthier، 6 سویه کنترل ATCC و 41 ایزوله بالینی و جدا شده از نمونه ادرار شامل استافیلوکوکوس اورئوس، اشریشیا کلی، سودوموناس آئروجینوزا، کلبسیلا پنومونیه، پروتئوس میرابیلیس، انتروکوکوس فکالیس و استفایلوکوکس اپیدرمیتیس و ساپروفیتیکوس تحت تأثیر 12 آنتی‌بیوتیک قرار گرفتند و با روش‌های رایج تعیین الگوی حساسیت آنتیبیوتیکی و فلوسایتومتری، الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیک آنها تعیین شد. نتایج به دست آمده در روش‌های انتشار در دیسک، میکرودایلوشن براث و فلوسایتومتری 9/93درصد مطابقت داشت (16). در تحقیق حاضر بیش از 98 درصد سلول‌ها پس از تأثیر غلظت‌های مورد مطالعه مروپنم و پیپراسیلین تازوباکتام زنده ماندند و همه 10 جدایه اسینتوباکتر بومانی نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و پیپراسیلین تازوباکتام با روش فلوسایتومتری مقاومت نشان دادند. نتایج تعیین الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی با هر سه روش انتشار در دیسک، میکرودایلوشن براث و فلوسایتومتری و بررسی معیار توافق بین روش‌ها نشان داد که 100، نتایج مطابقت دارد.
Soejima و همکاران توانستند از ترکیب تیمار اتیدیوم مونو آزید (ethidium monoazide (EMA)) با FCM به عنوان روشی سریع برای تمایز بین سلول‌های زنده و آسیب‌دیده باکتری لیستریا مونوساینتوژنز تحت تأثیر آنتی‌بیوتیک استفاده کند. این روش، بسیار سریعتر از سایر روش‌های رایج در دسترس که نیاز به صرف زمان طولانی برای انجام مراحل مختلف کشت دارد انجام شد (29). طی مطالعه Saint-Ruf و همکاران، حساسیت ایزوله‌های بالینی باکتری‌های گرم منفی اشریشیا کلی و سودوموناس ائروژینوزا را با سه کلاس از آنتی‌بیوتیک‌های بتالاکتام‌ها، آمینوگلیکوزیدها و فلوروکینولونها بررسی کردند. آنها علاوه بر فلوروکروم الکسا فلور هیدرازید 633 یا AFH، از TO-PRO®-3 استفاده کردند. این رنگ‌ها وارد غشاهای آسیب‌دیده سلول‌ها شده و به DNA متصل می‌شوند. در آن مطالعه روش فلوسایتومتری روشی برای اثبات تشخیص سریع و قابل اعتماد حساسیت آنتی‌بیوتیک مناسب تشخیص داده شد (30). Huang و همکاران، واکنش باکتری‌ها را با در معرض قرار گرفتن در مقابل آنتی‌بیوتیک توسط فلوسایتومتر بررسی کردند. دو سویه حساس (اشرشیا کلی و سودوموناس ائروژینوزا) و یک سویه مقاوم چنددارویی (ایزوله بالینی اشریشیا کلی) با رنگ IR786 رنگ‌آمیزی شدند و با آنتی‌بیوتیک‌های باکتریواستاتیک برای شناسایی تغییرات وارد شده در محدوده حداقل غلظت مهاری بررسی شدند. آسیب ناشی از آنتی‌بیوتیک به وسیله جریان سایتومتری بعد از 1 ساعت انکوباسیون از طریق پراکندگی رو به جلو (Fc)(Forward Scatter) ، پراکندگی کناری (SS)(Side Scatter ) و کانال‌های فلورسنس دیده شد. اختلاف آشکاری بین اطلاعات جریان سایتومتریک از باکتری تیمارنشده با آنتی‌بیوتیک و باکتری‌های تیمارشده با آنتی‌بیوتیک مشاهده شده بود (31). Huang و همکاران مجدداً در سال 2018 توانستند الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی پاتوژن‌های مقاوم چندگانه دارویی جداشده از خون مانند اشریشیا کلی، کلبسیلا پنومونیه و اسینتوباکتر نوسوکومیالیس را طی 8 ساعت از کشت اولیه خون بیماران با روش فلوسایتومتری تعیین کنند و گزارش دادند که با کاهش چشمگیر در زمان تشخیص و تعیین الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی می‌توان نتایج معالجه درمانی بیماران را به طور چشمگیری بهبود بخشید و میزان مقاومت آنتیبیوتیکی را کاهش داد (32).
فلوسایتومتری هزینه‌های بالایی ندارد، و سایتومتر می‌تواند بسیاری از مراحل پیپت کردن و شستشو را به صورت اتوماتیک انجام دهد. درحالیکه کارکنان طی روند‌های تست حساسیت مراحل مختلفی را جهت آماده‌سازی روش به کار می‌برند. از سوی دیگر، این روش اطلاعات متفاوتی از تعداد زیادی از باکتری‌ها با تلاش کمتر و زمان کمتری به دست می‌آورد. فلوسایتومتری قادر است جمعیت‌های متنوع میکروبی در یک سوسپانسیون را آنالیز کند و تنوع میکروبی را نشان دهد. این در حالی است که با روش‌های بر پایه کشت و MIC جمعیت‌های مختلف میکروبی در کشت قابل تمایز نیستند. کوتاه کردن زمان نتایج آنتی‌بیوگرام بیماران به ویژه بیماران بستری در بخش‌های ویژه با کوتاه کردن زمان روش‌های سنجش حساسیت آنتی‌بیوتیک جهت بهبود بیماران اهمیت ویژه‌ای دارد و مسیری رو به جلو برای تأثیر بیشتر و درمان به‌موقع این بیماران به وجود می‌آورد.
نتیجه‌گیری
نتایج تعیین الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی با روش فلوسایتومتری ،تنها 4 ساعت پس از تهیه سوسپانسیون میکروبی حاصل کشت شبانه‌روزی کلنی‌های باکتریایی به دست آمد و نشان داد که بیش از 98درصد از سلول‌های باکتریایی پس از تأثیر در غلظت‌های مختلف آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم و پیپراسیلین همچنان زنده باقی می‌مانند؛ این، با نتایج حاصل از روش انتشار در دیسک و روش MIC برای تعیین الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی ایزوله‌های اسینتوباکتر بومانی همخوانی داشت. این امر، اهمیت استفاده از فلوسایتومتر را به عنوان روشی سریع و حساس جهت تعیین الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی ایزوله‌های باکتریایی نشان می‌دهد. رنگ رودامین 123 به عنوان یک رنگ کاتیونی برای بررسی حساسیت آنتیبیوتیکی با روش فلوسایتومتر استفاده شد. با این حال، لزوم استفاده از سایر آنتی‌بیوتیک‌ها مانند جنتامیسین که در این مطالعه مقاومت کمتری نسبت به مروپنم و پیپراسیلین تازوباکتام نشان داده و تعیین الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی تعداد سویههای باکتریایی بیشتر به روش فلوسایتومتری در مطالعات آینده پیشنهاد می‌شود. از طرفی، زمان گرمخانه‌گذاری جدایه‌ها پس از تعیین منحنی رشد لگاریتمی باکتری مورد مطالعه امری است که باید به آن توجه شود. امروزه فلوسایتومتری برای تحقیقات و بیوتکنولوژی نه‌فقط مطلوب است بلکه ممکن است به‌زودی راه خود را به آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی بالینی باز کند و در طیف وسیع‌تری از مطالعات میکروبیولوژی به کار گرفته شود.سپاسگزاری
بدین‌وسیله از جناب آقای امید حسینی کارشناس آزمایشگاه جامع تحقیقاتی دانشگاه شهید بهشتی که ما را در اجرای این پژوهش یاری کردند، تقدیر و تشکر می‌شود.تعارض منافع
بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشی |
موضوع مقاله:
مقاومت پادزیستی (آنتی بیوتیکی)
دریافت: 1398/5/18 | پذیرش: 1398/9/1 | انتشار الکترونیک: 1398/9/1
دریافت: 1398/5/18 | پذیرش: 1398/9/1 | انتشار الکترونیک: 1398/9/1
فهرست منابع
1. Veal DA, Deere D, Ferrari B, Piper J, Attfield PV. Fluorescence staining and flow cytometry for monitoring microbial cells. Journal of Immunological Methods. 2000; 243:220-191. [DOI:10.1016/S0022-1759(00)00234-9]
2. Nuding S, Zabel LT. Detection, identification, and susceptibility testing of bacteria by flow cytometry. Journal of Bacteriology & Parasitology. 2013; S5-005. Doi: 10(4172):2155-9597 [DOI:10.4172/2155-9597.S5-005]
3. Kansanaho H, Isonen-Sjölund N, Pietilä K, Airaksinen M, Isonen T. Patient counselling profile in a Finnish pharmacy. Patient Education and Counseling. 2002; 47(1):77-82. [DOI:10.1016/S0738-3991(01)00180-X]
4. Huang TH, Ning X, Wang X, Murthy N, Tzeng YL, Dickson RM. Rapid cytometric antibiotic susceptibility testing utilizing adaptive multidimensional statistical metrics. Analytical chemistry. 2015; 87(3):1941-9. [DOI:10.1021/ac504241x] [PMID] [PMCID]
5. Wu L, Wang S, Song Y, Wang X, Yan X. Applications and challenges for single-bacteria analysis by flow cytometry. Science China Chemistry. 2016; 59(1):30-9. [DOI:10.1007/s11426-015-5518-3]
6. Fraser D, Kaern M. A chance at survival: gene expression noise and phenotypic diversification strategies. Molecular Microbiology. 2009; 71(6):1333-40. [DOI:10.1111/j.1365-2958.2009.06605.x] [PMID]
7. Rainey PB, Beaumont HJ, Ferguson GC, Gallie J, Kost C, Libby E, et al. The evolutionary emergence of stochastic phenotype switching in bacteria. 2011. 2011; 10(Suppl 1):S14. [DOI:10.1186/1475-2859-10-S1-S14] [PMID] [PMCID]
8. Paau AS Cowles JR, Oro J. Flow-microfluorometric analysis of Escherichia coli, Rhizobium meliloti, and Rhizobium japonicum at different stages of the growth cycle. Canadian journal of microbiology. 1977; 23(9):1165-9. [DOI:10.1139/m77-175] [PMID]
9. Hutter KJ, Eipel H. Microbial determinations by flow cytometry. Microbiology. 1979; 113(2):369-75. [DOI:10.1099/00221287-113-2-369] [PMID]
10. Haugland RP. Handbook of fluorescent probes and research chemicals. Eugene: Molecular Probes Inc.; 1996.
11. Shapiro HM. Microbial analysis at the single-cell level: tasks and techniques. Journal of Microbiological Methods. 2000; 42(1):3-16. [DOI:10.1016/S0167-7012(00)00167-6]
12. Sack U, Tárnok A, Rothe G. Cellular diagnostics: basic principles, methods and clinical applications of flow cytometry. Basel: Karger Medical and Scientific Publishers; 2009. [DOI:10.1159/isbn.978-3-8055-8556-9]
13. Suller M, Stark J, Lloyd D. A flow cytometric study of antibiotic-induced damage and evaluation as a rapid antibiotic susceptibility test for methicillin-resistant Staphylococcus aureus. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 1997; 40(1):77-83. [DOI:10.1093/jac/40.1.77] [PMID]
14. Mason D, Allman R, Stark J, Lloyd D. Rapid estimation of bacterial antibiotic susceptibility with flow cytometry. Journal of Microscopy. 1994; 176(1):8-16. [DOI:10.1111/j.1365-2818.1994.tb03494.x] [PMID]
15. Suller M, Lloyd D. Fluorescence monitoring of antibiotic‐induced bacterial damage using flow cytometry. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 1999; 35(3):235-41.
https://doi.org/10.1002/(SICI)1097-0320(19990301)35:3<235::AID-CYTO6>3.0.CO;2-0 [DOI:10.1002/(SICI)1097-0320(19990301)35:33.0.CO;2-0]
16. Gauthier C, Pierre STY, Villemure R. Rapid antimicrobial susceptibility testing of urinary tract isolates and samples by flow cytometry. Journal of Medical Microbiology.2002; 51:192-200. [DOI:10.1099/0022-1317-51-3-192] [PMID]
17. Zilberberg MD, Nathanson BH, Sulham K, Fan W, Shorr AF. Multidrug resistance, inappropriate empiric therapy, and hospital mortality in Acinetobacter baumannii pneumonia and sepsis. Critical Care. 2016; 20(1):221. [DOI:10.1186/s13054-016-1392-4] [PMID] [PMCID]
18. Visca P, Seifert H, Towner KJ. Acinetobacter infection-an emerging threat to human health. IUBMB life. 2011; 63(12):1048-54.
https://doi.org/10.1002/iub.534 [DOI:10.1002/iub.600] [PMID]
19. McConnell MJ, Actis L, Pachón J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiology Review. 2013; 37(2):130-55. [DOI:10.1111/j.1574-6976.2012.00344.x] [PMID]
20. Falagas ME, Karveli EA.The changing global epidemiology of Acinetobacter baumannii infections: a development with major public health implications. Clinical Microbiology and Infection. 2007; 13(2):117-9. [DOI:10.1111/j.1469-0691.2006.01596.x] [PMID]
21. Falagas ME, Bliziotis IA, Siempos II. Attributable mortality of Acinetobacter baumannii infections in critically ill patients: a systematic review of matched cohort and case-control studies. Critical Care. 2006; 10(2):R48. [DOI:10.1186/cc4869] [PMID] [PMCID]
22. Karbasizade V, Heidari L. Antimicrobial resistance of Acinetobacter baumannii isolated from Intensive Care Units of Isfahan hospitals, Iran. Journal of Isfahan Medical School. 2012; 30(191).
23. Ardebili A, Lari AR, Talebi M. Correlation of ciprofloxacin resistance with the AdeABC efflux system in Acinetobacter baumannii clinical isolates. Annals of Laboratory Medicine. 2014; 34(6):433-8. [DOI:10.3343/alm.2014.34.6.433] [PMID] [PMCID]
24. Moradi J, Hashemi FB, Bahador A. Antibiotic resistance of Acinetobacter baumannii in Iran: a systemic review of the published literature. Osong Public Health and Research Perspectives.2015;6(2):79-86. [DOI:10.1016/j.phrp.2014.12.006] [PMID] [PMCID]
25. Ghasemian R, Ahanjan M, Fatehi E, Shokri M. Prevalence and antibiotic resistance pattern of Acinetobacter isolated from patients admitted in ICUs in Mazandaran, Northern Iran. Global Journal of Health Science. 2016; 11(8):112-9. [DOI:10.5539/gjhs.v8n11p112]
26. Heinemann JA, Ankenbauer RG, Amábile-Cuevas CF. Do antibiotics maintain antibiotic resistance? Drug Discovery Today. 2000; 5(5):195-204. [DOI:10.1016/S1359-6446(00)01483-5]
27. Comas J,Vives-Rego J. Assessment of the effects of gramicidin, formaldehyde, and surfactants on Escherichia coli by flow cytometry using nucleic acid and membrane potential dyes. Cytometry.1997; 29:58-64.
https://doi.org/10.1002/(SICI)1097-0320(19970901)29:1<58::AID-CYTO6>3.0.CO;2-9 [DOI:10.1002/(SICI)1097-0320(19970901)29:13.0.CO;2-9]
28. Walberg M, Steent HB. Flow cytometric monitoring of bacterial susceptibility to antibiotics. Methods in Cell Biology. 2001; 64:553-66. [DOI:10.1016/S0091-679X(01)64029-9]
29. Soejima T, Minami JI, Iwatsuki K. The exclusive use of flow cytometry to evaluate the antibiotic-susceptibility. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 2012; 1820(12):1980-6. [DOI:10.1016/j.bbagen.2012.09.003] [PMID]
30. Saint-Ruf C, Crussard S, Franceschi C, Orenga S, Ouattara J, Ramjeet M, et al. Antibiotic susceptibility testing of the gram-negative bacteria based on flow cytometry. Frontiers in Microbiology. 2016; 7:1121. [DOI:10.3389/fmicb.2016.01121] [PMID] [PMCID]
31. Huang TH, Ning X, Wang X, Murthy N, Tzeng YL, Dickson RM. Rapid cytometric antibiotic susceptibility testing utilizing adaptive multidimensional statistical metrics. Analytical Chemistry. 2015; 87(3):1941-9. [DOI:10.1021/ac504241x] [PMID] [PMCID]
32. Huang TH, Tzeng Y, Land Dickson R. FAST: Rapid Determinations of Antibiotic Susceptibility Phenotypes using Label-Free. Cytometry Cytometry A . 2018; 93(6):63948. [DOI:10.1002/cyto.a.23370] [PMID] [PMCID]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
