سال 13، شماره 2 - ( خرداد - تیر 1398 )
جلد 13 شماره 2 صفحات 113-102 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Rezaei M, Kazemipour N, Vandyousefi J, Rokhbakhshzamin F, Irajian G. Determination of Dominant Serovars and Molecular Analysis of hly and iap Genes Related to Listeria monocytogenes Strains Isolated from Spontaneous Human Abortions in Tehran. Iran J Med Microbiol 2019; 13 (2) :102-113
URL: http://ijmm.ir/article-1-935-fa.html
URL: http://ijmm.ir/article-1-935-fa.html
رضائی مریم، کاظمی پور نادیا، وندیوسفی جلیل، رخ بخش زمین فرخ، ایراجیان غلامرضا. بررسی سروواریته‌های غالب لیستریا منوسیتوژنز با فنوتیپ و ژنوتیپ‌های جدا شده از سقط جنین‌های خودبخودی انسانی در تهران. مجله میکروب شناسی پزشکی ایران. 1398; 13 (2) :102-113
1- گروه میکروبشناسی، واحد کرمان، دانشگاه آزاد اسلامی، کرمان، ایران
2- آزمایشگاه تشخیص پزشکی شیلا، تهران، ایران ، info@shilalab.com
3- مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی میکروبی، دانشگاه علوم پزشکی ایران، تهران، ایران
2- آزمایشگاه تشخیص پزشکی شیلا، تهران، ایران ، info@shilalab.com
3- مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی میکروبی، دانشگاه علوم پزشکی ایران، تهران، ایران
واژه‌های کلیدی: لیستریا منوسیتوژنز، سروتیپ‌های غالب، ژن‌های iap و hly، سقط جنین خودبخودی، مولتی پلکس PCR
متن کامل [PDF 1482 kb]
(1811 دریافت)
| چکیده (HTML) (6889 مشاهده)
لیستریا منوسیتوژنز، باکتری گرم مثبت پاتوژن درون سلولی فرصت طلب و عامل عمدۀ عفونت‌های انسانی ناشی از غذا در سراسر جهان است. این باکتری از طریق غذاهای آمادۀ مصرف و فراورده‌های لبنی و گوشتی به انسان منتقل می‌شود و عامل عفونت‌های خطرناک در خانمهای باردار، افراد دارای مشکل ایمنی، نوزادان، افراد پیر و ناتوان است )5-1). اهمیت لیستریا منوسیتوژنز به دلیل مقاومت بالای باکتری در مقابل شرایط دشوار محیطی است. این پاتوژن در دمای 4 تا 45 درجه سلسیوس و pH 5/4 تا 9 و محیط دارای 10 درصد کلرید سدیم قادر به فعالیت است.
در این مطالعه تعداد 258 نمونۀ بالینی شامل 87 (33/7%) نمونه سواپ واژن، 118(45/8%) نمونه جفت و 53 (20/5%) در نمونه خون در شرایط استریل از 123 بیمار که در بیمارستان‌های مناطق چهارگانه تهران با عارضه سقط جنین خودبخودی که مورد تایید متخصص زنان و زایمان بود تهیه گردیدند. این پژوهش از اردیبهشت ماه 1395 تا فروردین ماه 1397 انجام شد و تشخیص باکتری بر مبنای جداسازی در محیط کشت بود. نمونه‌ها از ترشحات جفت جنین، ترشحات واژینال و خون تهیه و به مدت 6-4 هفته در محیط کشت
(Trytocase Soy Yeast Extract Broth) TSYEBدر 4 درجه سلسیوس سرماگذاری شدند. سپس بر روی محیط های پالکام و تریپتوز آگار (همراه با 0/6% عصاره مخمر با اضافه کردن 7% خون دفیبرینه گوسفند) کشت داده شد و به مدت 72 ساعت در گرمخانه 37 درجه سلسیوس نگه‌داری شدند (20-17).
تعیین فنوتیپ تهاجمی لیستریا منوسیتوژنز
کنگورد، ترکیبی محلول در آب است که پس از انحلال در آب تشکیل محلولی قرمز می‌دهد. در میکروب شناسی، این رنگ برای تشخیص کلونی‌های شیگلا فلکسنری سروتیپ a2 به کار می رود. در مورد باکتری لیستریا منوسیتوژنز به نظر می‌رسد کنگورد بیان ژن‌های بیماریزایی را تحریک نماید) 21).
تعیین سروتایپ های لیستریا منوسیتوژنز با استفاده از آنتی بادی منوکلونال
جهت تعیین سروتایپ و تشخیص سویه‌های غالب جداشده با روش سروآگلوتیناسیون با استفاده از آنتی بادی منوکلونال که از شرکت Denka Seiken Co.Tokyo,Japan تهیه شده بود استفاده گردید (15).
تست آنزیماتیک API(Analytical Profile Index)
از کیت‌های ردیابی ایمنوآنزیماتیک (Biomerieux) جهت تایید تشخیص جنس و گونه استفاده شد. از کلونی‌هایی که از نظر اختصاصات ظاهری و بیوشیمیایی به عنوان لیستریا تشخیص داده شدند سوسپانسیون معادل غلظت یک مک فارلند (CFU 108×3) تهیه گردید. روی کیت API ده تستی که حاوی آریل آمیداز، اسکولین، آلفا- مانوزیداز، د- آرابیتول، گلوکز 1-فسفات، د- گزیولوز، د- ریبوز، ال- رامنوز، آلفا متیل د-گلیکوزید، د- تاگاتوز بودند به نحوی انتقال داده شد که حبابی در چاهک‌ها تشکیل نشد و به مدت 24 ساعت در 37 درجه سلسیوس نگه‌داری شدند. پس از طی مدت زمان فوق یک قطره از معرف ZYmB روی خانه متعلق به آریل آمیداز ریخته شد. پس از سه دقیقه تغییرات رنگی چاهک ها با علامت مثبت و منفی و اعداد توصیفی دستورالعمل کیت، کدگذاری شده حاصل یک عدد چهار رقمی شد که با روش نرم‌افزاری کیت، لیستریا منوسیتوژنز‌ها مورد تایید قرار گرفتند )16).
تست تعیین حساسیت به آنتی بیوتیک های انتخابی
از تعداد 28 جدایه لیستریا منوسیتوژنز با سروتیپ‌های مختلف به روش رقت در آگار و تست آنتی‌بیوگرام به روش انتشار از دیسک انجام شد. در آزمایش حساسیت جدایه‌های لیستریا منوسیوتوژنز از سقط جنین‌های خودبخودی نسبت به آنتی‌بیوتیک‌ها با استفاده از دیسک‌های استاندارد موجود در بازار که دارای غلظت‌های متفاوتی بودند به روش انتشار از دیسک انجام گرفت. ابتدا سوسپانسیون میکروبی نیم مک فارلند (108×1/5) تهیه شد و توسط سواپ استریل به صورت یکنواخت در سطح محیط کشت مولرهینتون آگار پخش گردید. پس از 2 الی 5 دقیقه، تعداد 5 تا 7 دیسک از آنتی‌بیوتیک‌های مختلف توسط پنس استریل بر روی کشت باکتری قرار داده شدند و 14 تا 16 ساعت در 37 درجه سلسیوس گرما‌گذاری شدند. پس از گذشت زمان لازم، میزان حساسیت باکتری‌ها نسبت به آنتی‌بیوتیک‌ها با اندازه‌گیری قطر هاله عدم رشد توسط خط کش میلی‌متری با توجه به جدول NCCLS گزارش شدند (22).
بررسی بیماریزایی جدایه ها در شرایط in vivo
جهت بررسی بیماریزایی سروتیپ های لیستریا منوسیتوژنز جدا شده از سقط جنین‌های خودبخودی در شرایط in vivo با تزریق 0/4 سانتی‌متر مکعب از سوسپانسیون سروتیپ‌ها با غلظت 1 مک‌فارلند (معادلCFU/ml 108× 3) به 30 موش 20-18 گرمی در سه گروه 9 عددی همراه با یک گروه کنترل از راه صفاق انجام گردید (23).
بررسیهای مولکولی
قبل از انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، ابتدا DNA لیستریا منوسیتوژنز استخراج شده سپس عمل PCR طبق روش استاندارد انجام گرفت (27-24(.
طراحی پرایمر
واکنش PCR
برای انجام واکنش PCR، ابتدا Master Mix به حجم 13/5 میکرولیتر (بافرPCR 10X، Mgcl2، dNTPs، پرایمر، DNA الگو) تهیه و در لوله های 0/2 میلی لیتری تقسیم گردید. به این منظور سویه‌ای که از نظر وجود هر دو ژن مورد مطالعه مثبت بود را پس از تعیین توالی به عنوان کنترل مثبت در نظر گرفته شد. همچنین کنترل مثبت برای واکنش‌های بیوشیمیایی، لیستریا منوسیتوژنز (ATCC7644) استفاده شد. به‌منظور صحت مراحل کار و اطمینان از اختصاصی بودن پرایمرها سویه‌هایی از استافیلوکوکوس اورئوس (ATCC25923)، به عنوان کنترل منفی این مطالعه در نظر گرفته شدند. همچنین تعیین توالی ژن‌ها و سروتیپ ها مورد مطالعه قرار گرفت )24-27(.
در این پژوهش از 123 بیمار مبتلا به سقط جنین خودبخودی، تعداد 258 نمونه شامل 118 (45/8%) ترشحات جفت، 87 (33/7%) ترشحات واژینال و 53 (20/5%) مورد خون در شرایط کاملا استریل نمونه‌گیری انجام و با استفاده از روش‌های باکتری‌شناسی، سرولوژیکی و مولکولی شناسایی شدند.
سروتیپ‌های غالب، با استفاده از تکنیک‌های ایمنوسرولوژی با به کارگیری آنتی‌بادی‌های منوکلونال و تایید سروتیپ‌های جداشده به روش multiplex PCR در جدول 4 نشان داده شد.
با روش انتشار از دیسک، 7/77 % نسبت به پنی سیلین G و 11/11 % نسبت به کلرامفنیکل و استرپتومایسین مقاومت نشان دادند در حالی که نسبت به تریمتوپریم- سولفامتوکسازول، اریترومایسین و نورفلوکساسین حساسیت کامل نشان داده شد (جدول شماره 5) (22).
جدول 3. درصد جداسازی لیستریا منوسیتوژنز از نمونه های مختلف کلینیکی
جدول 4. درصد فراوانی سروتیپ‌های غالب جداشده لیستریا منوسیتوژنز از نمونه‌های کلینیکی
جدول شماره 5. نتیجه حساسیت لیستریا منوسیتوژنز به 10 عامل آنتی‌بیوتیکی (اعداد به درصد هستند)
جدول 7. توزیع فراوانی سروتیپ های غالب a1/2، b4 و c2 و ژن های hlyA
شکل 3. تعیین توالی و با استفاده از نرم افزار Blast (Listeria monocytogenes hlyA)
شکل 4. تعیین توالی و با استفاده از نرم افزار Blast (Listeria monocytogenes 2c iap)
بروز لیستریوز در زنان باردار با سقط جنین‌های خودبخودی، 12 نفر از هر صد هزار نفر است در صورتی که در افراد سالم 0/07 درصد گزارش شده است (7) که طبق گزارشات، یک سوم از لیستریوزیس انسانی مربوط به سقط جنین خودبخودی بوده است و اغلب در سه ماهه دوم یا اوایل سه ماهه سوم اتفاق می افتد (7، 27). لذا بر اهمیت تشخیص این باکتری تاکید می‌شود. در این پژوهش با اخذ نمونه‌های کلینیکی از 123 بیمار سقط جنین خودبخودی که شامل 258 نمونه‌هایی از جفت جنین (118)، ترشحات واژینال (87) و خون بیمار (53) مورد بودند انجام پذیرفت.
با استفاده از روش‌های فنوتیپی و ژنوتیپی، 28 مورد (10/8%) لیستریا منوسیتوژنز که 21 مورد (17/7%) از جفت و 2 مورد(3/7%) از خون و 5 مورد (5/7%) از ترشحات واژینال، لیستریا منوسیتوژنز جدا گردید که سروتیپ‌های a1/2، 9مورد (42/8%) از جفت جنین و 2 مورد (100%) از خون و 3 مورد (60%) از ترشحات واژینال و همچنین سروتیپ b4 به ترتیب 8 مورد (38%)، صفر مورد (صفر%) و 2 مورد (40%) از ترشحات جفت جنین، خون و ترشحات واژینال شناسایی شدند. غالب بودن سروتیپ a1/2 با 14 مورد (50%) نسبت به سروتیپ b4 با 10 مورد (35/7%) مشخص گردید. همچنین 4 مورد (14/2%) سروتیپ c2 از سقط جنین‌های خودبخودی برای اولین بار در ایران گزارش و با تطبیق مشخصات فنوتیپی و ژنوتیپی با سویه‌های پراکنده که با سروتیپ‌های a1/2 و b4 از مواد غذایی در ایران گزارش شده در این بررسی مطالعه شدند. جهت ارزیابی دو ژن hly, iap که موثرترین ژن‌ها در سقط جنین‌های خود بخودی هستند از نظر ژنوتیپی مطالعه هستند. طبق یافته‌های مولکولی با روشMultiplex PCR وجود ژن hlyA در تمام سروواریته‌های غالب (100%) و ژن iap با (85/7%) در 24 مورد از سروواریته‌های غالب، بیانگر این مهم است که وجود این دو ژن در این سروتیپ‌ها باعث بروز سقط جنین‌های خودبخودی است و از نظر این که 4 مورد از سروواریته‌های a1/2 فاقد ژن iap بودند، همین مسئله باعث کاهش شدت و حدت باکتری شده و عامل مهم و موثر در تاخیر سقط جینن‌های خودبخودی بوده که از یافته‌های بسیار مهم این مطالعه است.
طبق نتایج مولتی پلکس PCR، 28 سروتیپ غالب a1/2 و b4 شناسایی که شامل 14 مورد سروتیپ a1/2، 10 مورد سروتیپ b4 و 4 مورد سروتیپ c2 بودند که همگی دارای ژن hlyA، کد کننده لیستریولیزین O بودند که عمده‌ترین و مهمترین ژن لیستریا منوسیتوژنز از نظر نشانگر ساختن جنس باکتری و سروتیپ‌های وابسته به آن و همچنین از نظر بیماریزایی است. وجود ژن iapدر تمام سروتیپ‌ها بر شدت و حدت بیماریزایی باکتری می‌افزاید و برای اولین بار، نشان داده شد. چهار سروتیپ a2/1 که فاقدژنiap بودند باعث تاخیر در سقط جنین گردیده است به طوریکه هر چهار مورد سقط، در ترم سوم حاملگی رخ داد، و مرگ و میر موش‌ها چهار هفته پس از تزریق اتفاق افتاد، همچنین می‌توان گفت امکان جهش در ژن iap به علت پلی‌مورف بودن توالی مرکزی، با پرایمرهای انتخابی پژوهش حاضر دلیل دیگری بر این امر است (28).
در مطالعه حاضر از 258 نمونه کلینیکی 28 مورد لیستریا منوسیتوژنز جدا شده که سرووارهای غالب a1/2 و b4 بودند با مطالعه دکتر Shayan و همکاران در سال 1387 بر روی 100 نمونه که عمدتا از ترشحات واژن انجام گرفته بود از نظر نسبت آماری با مطالعات نامبرده مطابقت دارد (24 (در صورتی که مطالعه کارگر و همکاران در سال 2009 شیوع لیستریا منوسیتوژنز در موارد سقط انسانی به صورت 13/1% گزارش شده است (18) در مجموع، شیوعِ بالاتر گزارش شده در مطالعات کارگر در مقایسه با پژوهش حاضر می تواند به دلیل انجام مطالعه از مناطق محروم کشور و تفاوت سطح بهداشتی درآن مناطق با تهران باشد.
در سال 2009 انجام مطالعات Jamshidi و همکاران در ارتباط با تیتر آنتی بادی لیستریا منوسیتوژنز و سقط های خودبخودی روی سرم 200 خانم باردار که درمطالعات کلینیکی احتمال سقط خودبخودی داشتند در منطقه بندر عباس انجام گرفت و عیار بالاتر از 1/400 را جهت پیش آگاهی از بروز سقط جنین‌های خودبخودی اعلام نمودند و سرووار غالب در مطالعه ایشان سروواریته b4 بود (19) در صورتی که دربررسی های پژوهش حاضر سروتیپ a1/2 به عنوان سروواریته غالب شناسایی گردید.
در سال 2013 Jamali و همکاران، لیستریا منوسیتوژنز را از مواد غذایی مختلف اعم از خام یا آماده به مصرف با استفاده از روش های باکتریولوژیکی، جداسازی و به عنوان یک عامل مخاطره انگیز جهت بهداشت انسان، بخصوص در افراد مسن و افراد با نقص سیستم ایمنی و کودکان وخانم‌های باردار معرفی کردند (20). این بررسی هم از نظر فنوتیی و هم از نظر ژنوتیپی با بررسی پژوهش حاضر مغایرت داشته ولی نمایانگر این موضوع است که لیستریا منوسیتوژنز یک باکتری مخاطره انگیز دربهداشت جامعه است.
دکتر Nematollahi و همکاران درسال 1394 در پژوهشی تحت عنوان «بررسی فراوانی لیستریا منوسیتوژنز در زنان باردار اراک» توانستند از 540 نمونه واژن و ادرار زن باردار با روش کشت، تعداد 14 مورد لیستریا منوسیتوژنز جدا کنند. 8 مورد دارای سابقه سقط و 6 مورد فاقد سقط بوده‌اند. در این پژوهش متغیر سن مد نظر بود ولی پژوهش از نظر ژنوتیپی انجام نپذیرفته بود. در این پژوهش فقط پراکندگی لیستریا منوسیتوژنز به‌عنوان یکی از عوامل سقط جنین در خانم‌ها گزارش گردیده است (29).
در سال 2009 دکتر Kargar و همکاران تعداد 428 نمونه شیر تازه را بررسی کردند و تعداد 56 نمونه (13/1%) لیستریا منوسیتوژنز را جداسازی نمودند که 91/7% از آنها با روش مولتی پلکس PCR ژن hly را شناسایی و برای اولین بار پراکندگی ژن hly را در مواد غذایی و سقط جنین از مرودشت شیراز گزارش نمودند (18). در مطالعه Kargar و همکاران به دلیل انجام پژوهش در مناطق محروم کشور و اختلاف سطح بهداشت در مقایسه با تهران، میزان شیوع بالایی از لیستریوزیس در انسان- نسبت به پژوهش ما- گزارش گردید. این پژوهش از جنبه نقش ژن hlyدر سقط با پژوهش حاضر همسانی داشته اما از جنبه تعیین سایر سروتیپ‌های لیستریا وسایر ژن های موثر مطابقت ندارد.
در سال 1396 Kalantaripour و همکاران، از تعداد 100 نمونه پنیر سنتی به صورت تصادفی جمع آوری و با استفاده از روش های متداول کشت جداسازی وشناسایی کردند. از 12 نمونه لیستریای جداشده 5 جدایه مربوط به لیستریا منوسیتوژنز و 7 نمونه جداشده مربوط به لیستریا ایوانووی بودند. ولی از نظر ژنوتیپی جهت بررسی سویه‌های غالب کار پژوهشی انجام ندادند (30).
در سال 2013 Jahangir و همکاران 311 نمونه را که شامل ادرار، خون، مایع آمنیوتیک و سواپ واژینال از 157 زن باردار اخذ شده بود از نظر لیستریا منوسیتوژنز مورد بررسی قرار دادند که هدف این مطالعه تاکید بر جداسازی ژن hly A بود که 19 نمونه اخذ شده از زنان باردار با سابقه سقط خودبخودی و 120 نمونه از خانم های باردار بدون عوارض سقط جنین تهیه گردیده بودکه با بررسیهای مولکولی نشان دادند 10/28% از افراد مورد مطالعه دارای ژن hly A بودند که عمدتا در خانمهای با علائم سقط و در سنین بین 30-26 اتفاق افتاده بود (25(. در این بررسی بدون این که سایر ژن های مداخله گر را نیز مورد مطالعه قرار دهند عمدتا ژن hlyA را به‌عنوان یک ژن تهاجمی معرفی نموده و ژن‌های موثر دیگر را مدنظر قرار نداده و غالب بودن سروتیپ‌ها نیز نامشخص مانده است. در پژوهش حاضر با شناسایی دو عامل فنوتیپی و ژنوتیپی و امکان وجود موتاسیون در ژنوتیپ‌های مورد مطالعه نکات مبهم مشخص شد.
در سال 2014 Eslami و همکاران جهت بررسی فاکتورهای ویرولانس در96 مورد سقط خودبخودی، وجود ژن‌های plcA R hly را در 16 مورد به روش PCR شناسایی کردند. میزان درصد بروز ژن hly در لیستریا منوسیتوژنز بیش از plcA بوده است (26). در این پژوهش نیز بررسی سویه‌های غالب مشخص نشده بود و دلیل انتخاب این دو ژن در سقط جنین‌های مورد مطالعه معلوم نبود. همچنین شناسایی سروتیپ‌های غالب انجام نپذیرفته بود که با مقایسه با پژوهش حاضر مغایرت داشته است.
Pournajaf و همکاران در سال 2016، تعداد 617 نمونه از موارد کلینیکی و غیر کلینیکی مشکوک به لیسیتریا منوسیتوژنز را با روش Multiplex PCR جهت ارزیابی ژن های Inl A,C,J انجام دادند که از این تعداد نمونه 46 (7/45%) مورد لیستریا منوسیتوژنز جدا نمودند و نامبردگان نشان دادند وجود این سه ژن بیانگر بیماریزایی لیستریا منوسیتوژنز است و متذکر شدند وجود یک ژن برای اثبات بیماریزایی این باکتری کافی و قابل تفسیر نیست (27). این پژوهش با پژوهش حاضر از نظر موضوع کاملا مغایرت داشته فقط بیانگر این حقیقت است که وجود چند ژن در لیستریا می‌تواند حدت بیماریزایی را افزایش داده و عوارض کلینیکی مربوط به این باکتری را بوجود بیاورد. همچنان که در پژوهش ما نقش دو ژن hly و iap مشخص گردید (28).
در سال 1392 Pournajaf و همکاران تعداد 46 (7/4%) ایزوله لیستریا منوسیتوژنز از کل 617 نمونه جمع آوری شده جدا کردند که از 170 نمونه بالینی تعداد 14(8/2%) به ترتیب 7/5%، 5/7%، 14/2%، 8/5% از جفت، ادرار، واژن و رکتال جدا شدند. در مطالعه حاضر فقط گونه لیستریا منوسیتوژنز مشخص گردید و پژوهشگران سروتایپینگ سروتیپ های شایع دخیل در لیستریوز انسانی را در مطالعات آینده پیشنهاد نمودند (31). در مطالعۀ ما تعیین سروتیپ‌های غالب و دخیل در سقط جنین‌های خودبخودی انسانی مشخص و غالب بودن a1/2 و b4 مشخص گردید و برای اولین بار سروتیپ c2 که از سقط جنین‌های خودبخودی انسانی جدا شده بود از ایران گزارش شد (28).
Kumar در سال 2015 تعداد 3700 نمونه کلینیکی از خانمهای حامله در هند جمع‌آوری و بر اساس آزمایشات سروتایپینگ، ژنوتایپینگ و بیماریزایی در شرایط in vivo مطالعه کرد که از 30 مورد (0/8%) نمونه‌ها پس از آزمایشات لازم، لیستریا منوسیتوژنز جدا گردید که اکثر سویه‌ها از سروتیپ b4 بودند و 20 مورد نمونه‌ها واجد ژن‌هایactA ,prfA, plc A, hly,InlA, inlC,InlY, iap و 6 مورد فاقد ژن‌های مذکور بودند (23). این مطالعه با اهداف اصلی پژوهش حاضر چه از نظر روش‌های فنوتیپی و چه از نظر ژنوتیپی مطابقت کامل داشته ولی غالب بودن اکثر سروتیپ‌ها و اولویت تاثیر‌گذاری ژن‌های جدا شده را مشخص ننموده است.
در سال 2017 Lotfollahi و همکاران، تعداد 442 نمونه های انسانی، دامی و غذایی را با روش مولتی پلکس PCR مطالعه کردند و سروتیپ‌های c1/2 (یا c3)،b 4، d4(یا e4) و a1/2 (یا a3) را برای اولین بار از نمونه‌های انسانی و دامی شناسایی نمودند (32) در صورتی که در مطالعه حاضر سروتیپ‌های a1/2 و b4 به عنوان سروتیپ‌های غالب شناسایی و جداسازی c1/2 از سقط جنین‌های خودبخودی برای اولین بار در ایران گزارش گردید.
به طور کلی یافته‌های حاصل از تحقیق انجام یافته نشانگر سروتیپ‌های a1/2 و b4به‌عنوان سروتیپ‌های غالب لیستریا منوسیتوژنز در سقط جنین‌های خودبخودی است و بررسیهای باکتریولوژیکی و مولکولی نشان داد که سروتیپ c2 در سقط جنین‌های خودبخودی اثرگذار و برای اولین بار در ایران گزارش شود.
از تمامی همکارانی که در انجام این پژوهش ما را یاری رساندند، سپاسگزاریم.
بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.
متن کامل: (4636 مشاهده)
مقدمه
لیستریا منوسیتوژنز، باکتری گرم مثبت پاتوژن درون سلولی فرصت طلب و عامل عمدۀ عفونت‌های انسانی ناشی از غذا در سراسر جهان است. این باکتری از طریق غذاهای آمادۀ مصرف و فراورده‌های لبنی و گوشتی به انسان منتقل می‌شود و عامل عفونت‌های خطرناک در خانمهای باردار، افراد دارای مشکل ایمنی، نوزادان، افراد پیر و ناتوان است )5-1). اهمیت لیستریا منوسیتوژنز به دلیل مقاومت بالای باکتری در مقابل شرایط دشوار محیطی است. این پاتوژن در دمای 4 تا 45 درجه سلسیوس و pH 5/4 تا 9 و محیط دارای 10 درصد کلرید سدیم قادر به فعالیت است.
در ایالت متحده آمریکا سالیانه حدود 2500 مورد لیستریوز تهاجمی ناشی از لیستریا منوسیتوژنز گزارش می‌شود که منجر به مرگ و میر 500 نفر در سال می‌شود )4). طیف بالینی لیستریوزیس از تحت بالینی تا عفونت‌های منتشره با دو هدف اختصاصی یعنی واحد جفت- مادری و سیستم عصبی مرکزی متغیر است (6).
در سال‌های اخیر، این باکتری به‌عنوان الگویی جهت مطالعه ژنتیکی زندگی میکروارگانیسم‌های داخل سلولی مطرح شده است. این باکتری از مکانیسم‌های ضد میکروبی فاگوسیت‌ها می‌گریزد. لیستریا منوسیتوژنز این عمل را با فرار از فاگوزوم به درون فضای سیتوزولی انجام می‌دهد. پروتئین‌های دخیل در این واکنش، نوعی از همولیزین هستند که غشاء فاگوزومی را هدف قرار می دهند (6،4).
از سوی دیگر توانایی باکتری در عبور از واحد جنینی- جفتی اهمیت فراوانی دارد؛ زیرا لیستریوزیس در زنان باردار می‌تواند منجر به سقط جنین، زایمان زودرس و عوارضی جدی بعد از تولد شود. مهمترین عارضه شناخته شده آن، مننژیت نوزادی است )6،7). لیستریا منوسیتوژنز با باکتری درون سلولی اختیاری است و از طریق ویژگی‌هایی مانند، اشتراک بین انسان و حیوان (zoonotic)، منتقله از راه مصرف مواد غذایی (Food-borne)، خاک و خاشاک (Sapronose) و سرمادوستی (Psyhcrophil)، انسان را آلوده می‌کند. همچنین با توجه سروواریته‌های مختلف 7، ab4، c4،c 3، c1/2 ،b 4، a4، b3،a 3،b 1/2،a 1/2، پراکندگی وسیعی در طبیعت دارد شناسایی این سروواریته ها در مواد غذایی و موارد انسانی به طور پراکنده گزارش شده ولی شناسایی و غالب بودن آن ها در سقط جنین های خودبخودی مورد پژوهش قرار نگرفته است. انجام این پژوهش، ارتباط زنجیره ای بین سروتیپ های جداشده از نمونه های غذایی و سقط جنین های انسانی خودبخودی را ثابت می کند. انجام این پژوهش، ارتباط زنجیره‌ای بین سروتیپ‌های جدا شده از نمونه های غذایی و موارد انسانی اختصاصی سقط جنین‌های خود بخودی را ثابت می‌کند )10-8).
مطالعات انجام شده در مورد شناسایی ژنوتیپ‌های لیستریا منوسیتوژنز فقط نشانگر مجموعه‌ای از ژن‌های (mpl, hlyA,prfA ,plc A,B,act A, iap,ctpA) در لیستریا منوسیتوژنز است. تاکنون مطالعاتی برای تشخیص این که کدام یک از سروتیپ‌های غالب دارای دو ژن تهاجمی iap و hlyA هستند، انجام نیافته است. ممکن است، یکی از علل سقط‌های خود بخودی، تهاجمی بودن این دو ژن در یک دوره از بارداری باشد و این که چند درصد از سروتیپ‌های حاوی این ژن‌ها در سقط جنین‌های خود بخودی موثر هستند.
معرفی سویه‌های باکتریایی با فنوتیپ‌های پاتوژنتیکی مرگ‌آور و خطرناک، توسعه مقاومت به چندین آنتی‌بیوتیک و همچنین کسب روش‌های جدید انتقال ژن در بین میکروارگانیسم‌های میزبان، محققین را برای شناسایی و کنترل منشاء و انتشار واریانت‌های ژنتیکی داخل یک گونه دچار سردرگمی کرده است. با تایپینگ مولکولی می‌توان شیوع عفونت‌های بیمارستانی، شناسایی مخازن آلودگی، جداسازی ژنوتیپ‌های خاص در کونژوگاسیون با یک باکتری خاص را مشخص کرد. در حال حاضر تکنیک‌های متعددی برای تیپ‌بندی و بررسی ارتباط تکاملی لیستریا منوسیتوژنز وجود دارد مانند PFGE (Pulsed Filed Gel Electrophoresis) که به عنوان استاندارد طلایی تایپینگ برای بسیاری از باکتری‌ها مطرح است ولی این تکنیک بسیار زمان بر، پر هزینه و تفسیر داده‌های آن بسیار مشکل است (14-11).
بهترین روش‌های مولکولی، تکنیک‌های Multilocus Sequences Typing) HRM (High Resolution Melt ,MLST Analysis) وRealtime PCR می‌باشند که هریک از روش‌ها، مزیت‌های خاص خود را دارند. در این پژوهش با توجه به امکانات از روش Multiplex PCR استفاده گردید که از حساسیت و ویژگی خاصی برخودار است (15،16).
در سال‌های اخیر، این باکتری به‌عنوان الگویی جهت مطالعه ژنتیکی زندگی میکروارگانیسم‌های داخل سلولی مطرح شده است. این باکتری از مکانیسم‌های ضد میکروبی فاگوسیت‌ها می‌گریزد. لیستریا منوسیتوژنز این عمل را با فرار از فاگوزوم به درون فضای سیتوزولی انجام می‌دهد. پروتئین‌های دخیل در این واکنش، نوعی از همولیزین هستند که غشاء فاگوزومی را هدف قرار می دهند (6،4).
از سوی دیگر توانایی باکتری در عبور از واحد جنینی- جفتی اهمیت فراوانی دارد؛ زیرا لیستریوزیس در زنان باردار می‌تواند منجر به سقط جنین، زایمان زودرس و عوارضی جدی بعد از تولد شود. مهمترین عارضه شناخته شده آن، مننژیت نوزادی است )6،7). لیستریا منوسیتوژنز با باکتری درون سلولی اختیاری است و از طریق ویژگی‌هایی مانند، اشتراک بین انسان و حیوان (zoonotic)، منتقله از راه مصرف مواد غذایی (Food-borne)، خاک و خاشاک (Sapronose) و سرمادوستی (Psyhcrophil)، انسان را آلوده می‌کند. همچنین با توجه سروواریته‌های مختلف 7، ab4، c4،c 3، c1/2 ،b 4، a4، b3،a 3،b 1/2،a 1/2، پراکندگی وسیعی در طبیعت دارد شناسایی این سروواریته ها در مواد غذایی و موارد انسانی به طور پراکنده گزارش شده ولی شناسایی و غالب بودن آن ها در سقط جنین های خودبخودی مورد پژوهش قرار نگرفته است. انجام این پژوهش، ارتباط زنجیره ای بین سروتیپ های جداشده از نمونه های غذایی و سقط جنین های انسانی خودبخودی را ثابت می کند. انجام این پژوهش، ارتباط زنجیره‌ای بین سروتیپ‌های جدا شده از نمونه های غذایی و موارد انسانی اختصاصی سقط جنین‌های خود بخودی را ثابت می‌کند )10-8).
مطالعات انجام شده در مورد شناسایی ژنوتیپ‌های لیستریا منوسیتوژنز فقط نشانگر مجموعه‌ای از ژن‌های (mpl, hlyA,prfA ,plc A,B,act A, iap,ctpA) در لیستریا منوسیتوژنز است. تاکنون مطالعاتی برای تشخیص این که کدام یک از سروتیپ‌های غالب دارای دو ژن تهاجمی iap و hlyA هستند، انجام نیافته است. ممکن است، یکی از علل سقط‌های خود بخودی، تهاجمی بودن این دو ژن در یک دوره از بارداری باشد و این که چند درصد از سروتیپ‌های حاوی این ژن‌ها در سقط جنین‌های خود بخودی موثر هستند.
معرفی سویه‌های باکتریایی با فنوتیپ‌های پاتوژنتیکی مرگ‌آور و خطرناک، توسعه مقاومت به چندین آنتی‌بیوتیک و همچنین کسب روش‌های جدید انتقال ژن در بین میکروارگانیسم‌های میزبان، محققین را برای شناسایی و کنترل منشاء و انتشار واریانت‌های ژنتیکی داخل یک گونه دچار سردرگمی کرده است. با تایپینگ مولکولی می‌توان شیوع عفونت‌های بیمارستانی، شناسایی مخازن آلودگی، جداسازی ژنوتیپ‌های خاص در کونژوگاسیون با یک باکتری خاص را مشخص کرد. در حال حاضر تکنیک‌های متعددی برای تیپ‌بندی و بررسی ارتباط تکاملی لیستریا منوسیتوژنز وجود دارد مانند PFGE (Pulsed Filed Gel Electrophoresis) که به عنوان استاندارد طلایی تایپینگ برای بسیاری از باکتری‌ها مطرح است ولی این تکنیک بسیار زمان بر، پر هزینه و تفسیر داده‌های آن بسیار مشکل است (14-11).
بهترین روش‌های مولکولی، تکنیک‌های Multilocus Sequences Typing) HRM (High Resolution Melt ,MLST Analysis) وRealtime PCR می‌باشند که هریک از روش‌ها، مزیت‌های خاص خود را دارند. در این پژوهش با توجه به امکانات از روش Multiplex PCR استفاده گردید که از حساسیت و ویژگی خاصی برخودار است (15،16).
مواد و روش ها
در این مطالعه تعداد 258 نمونۀ بالینی شامل 87 (33/7%) نمونه سواپ واژن، 118(45/8%) نمونه جفت و 53 (20/5%) در نمونه خون در شرایط استریل از 123 بیمار که در بیمارستان‌های مناطق چهارگانه تهران با عارضه سقط جنین خودبخودی که مورد تایید متخصص زنان و زایمان بود تهیه گردیدند. این پژوهش از اردیبهشت ماه 1395 تا فروردین ماه 1397 انجام شد و تشخیص باکتری بر مبنای جداسازی در محیط کشت بود. نمونه‌ها از ترشحات جفت جنین، ترشحات واژینال و خون تهیه و به مدت 6-4 هفته در محیط کشت
(Trytocase Soy Yeast Extract Broth) TSYEBدر 4 درجه سلسیوس سرماگذاری شدند. سپس بر روی محیط های پالکام و تریپتوز آگار (همراه با 0/6% عصاره مخمر با اضافه کردن 7% خون دفیبرینه گوسفند) کشت داده شد و به مدت 72 ساعت در گرمخانه 37 درجه سلسیوس نگه‌داری شدند (20-17).
تعیین فنوتیپ تهاجمی لیستریا منوسیتوژنز
کنگورد، ترکیبی محلول در آب است که پس از انحلال در آب تشکیل محلولی قرمز می‌دهد. در میکروب شناسی، این رنگ برای تشخیص کلونی‌های شیگلا فلکسنری سروتیپ a2 به کار می رود. در مورد باکتری لیستریا منوسیتوژنز به نظر می‌رسد کنگورد بیان ژن‌های بیماریزایی را تحریک نماید) 21).
تعیین سروتایپ های لیستریا منوسیتوژنز با استفاده از آنتی بادی منوکلونال
جهت تعیین سروتایپ و تشخیص سویه‌های غالب جداشده با روش سروآگلوتیناسیون با استفاده از آنتی بادی منوکلونال که از شرکت Denka Seiken Co.Tokyo,Japan تهیه شده بود استفاده گردید (15).
تست آنزیماتیک API(Analytical Profile Index)
از کیت‌های ردیابی ایمنوآنزیماتیک (Biomerieux) جهت تایید تشخیص جنس و گونه استفاده شد. از کلونی‌هایی که از نظر اختصاصات ظاهری و بیوشیمیایی به عنوان لیستریا تشخیص داده شدند سوسپانسیون معادل غلظت یک مک فارلند (CFU 108×3) تهیه گردید. روی کیت API ده تستی که حاوی آریل آمیداز، اسکولین، آلفا- مانوزیداز، د- آرابیتول، گلوکز 1-فسفات، د- گزیولوز، د- ریبوز، ال- رامنوز، آلفا متیل د-گلیکوزید، د- تاگاتوز بودند به نحوی انتقال داده شد که حبابی در چاهک‌ها تشکیل نشد و به مدت 24 ساعت در 37 درجه سلسیوس نگه‌داری شدند. پس از طی مدت زمان فوق یک قطره از معرف ZYmB روی خانه متعلق به آریل آمیداز ریخته شد. پس از سه دقیقه تغییرات رنگی چاهک ها با علامت مثبت و منفی و اعداد توصیفی دستورالعمل کیت، کدگذاری شده حاصل یک عدد چهار رقمی شد که با روش نرم‌افزاری کیت، لیستریا منوسیتوژنز‌ها مورد تایید قرار گرفتند )16).
تست تعیین حساسیت به آنتی بیوتیک های انتخابی
از تعداد 28 جدایه لیستریا منوسیتوژنز با سروتیپ‌های مختلف به روش رقت در آگار و تست آنتی‌بیوگرام به روش انتشار از دیسک انجام شد. در آزمایش حساسیت جدایه‌های لیستریا منوسیوتوژنز از سقط جنین‌های خودبخودی نسبت به آنتی‌بیوتیک‌ها با استفاده از دیسک‌های استاندارد موجود در بازار که دارای غلظت‌های متفاوتی بودند به روش انتشار از دیسک انجام گرفت. ابتدا سوسپانسیون میکروبی نیم مک فارلند (108×1/5) تهیه شد و توسط سواپ استریل به صورت یکنواخت در سطح محیط کشت مولرهینتون آگار پخش گردید. پس از 2 الی 5 دقیقه، تعداد 5 تا 7 دیسک از آنتی‌بیوتیک‌های مختلف توسط پنس استریل بر روی کشت باکتری قرار داده شدند و 14 تا 16 ساعت در 37 درجه سلسیوس گرما‌گذاری شدند. پس از گذشت زمان لازم، میزان حساسیت باکتری‌ها نسبت به آنتی‌بیوتیک‌ها با اندازه‌گیری قطر هاله عدم رشد توسط خط کش میلی‌متری با توجه به جدول NCCLS گزارش شدند (22).
بررسی بیماریزایی جدایه ها در شرایط in vivo
جهت بررسی بیماریزایی سروتیپ های لیستریا منوسیتوژنز جدا شده از سقط جنین‌های خودبخودی در شرایط in vivo با تزریق 0/4 سانتی‌متر مکعب از سوسپانسیون سروتیپ‌ها با غلظت 1 مک‌فارلند (معادلCFU/ml 108× 3) به 30 موش 20-18 گرمی در سه گروه 9 عددی همراه با یک گروه کنترل از راه صفاق انجام گردید (23).
بررسیهای مولکولی
قبل از انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، ابتدا DNA لیستریا منوسیتوژنز استخراج شده سپس عمل PCR طبق روش استاندارد انجام گرفت (27-24(.
طراحی پرایمر
جدول1. توالی پرایمرهای استفاده شده برای ژن‌های hly, iap در این مطالعه(27-24)
واکنش PCR
برای انجام واکنش PCR، ابتدا Master Mix به حجم 13/5 میکرولیتر (بافرPCR 10X، Mgcl2، dNTPs، پرایمر، DNA الگو) تهیه و در لوله های 0/2 میلی لیتری تقسیم گردید. به این منظور سویه‌ای که از نظر وجود هر دو ژن مورد مطالعه مثبت بود را پس از تعیین توالی به عنوان کنترل مثبت در نظر گرفته شد. همچنین کنترل مثبت برای واکنش‌های بیوشیمیایی، لیستریا منوسیتوژنز (ATCC7644) استفاده شد. به‌منظور صحت مراحل کار و اطمینان از اختصاصی بودن پرایمرها سویه‌هایی از استافیلوکوکوس اورئوس (ATCC25923)، به عنوان کنترل منفی این مطالعه در نظر گرفته شدند. همچنین تعیین توالی ژن‌ها و سروتیپ ها مورد مطالعه قرار گرفت )24-27(.
جدول 2. شرایط انجام PCR
آنالیز آماری داده ها
جهت تجزیه و تحلیل داده‌ها، از نرم افزار Epi Infoنسخه 7.1.3.10 و تست Chi-Square به ازای 0/05<P استفاده شد.
جهت تجزیه و تحلیل داده‌ها، از نرم افزار Epi Infoنسخه 7.1.3.10 و تست Chi-Square به ازای 0/05<P استفاده شد.
یافته ها
در این پژوهش از 123 بیمار مبتلا به سقط جنین خودبخودی، تعداد 258 نمونه شامل 118 (45/8%) ترشحات جفت، 87 (33/7%) ترشحات واژینال و 53 (20/5%) مورد خون در شرایط کاملا استریل نمونه‌گیری انجام و با استفاده از روش‌های باکتری‌شناسی، سرولوژیکی و مولکولی شناسایی شدند.
سروتیپ‌های غالب، با استفاده از تکنیک‌های ایمنوسرولوژی با به کارگیری آنتی‌بادی‌های منوکلونال و تایید سروتیپ‌های جداشده به روش multiplex PCR در جدول 4 نشان داده شد.
با روش انتشار از دیسک، 7/77 % نسبت به پنی سیلین G و 11/11 % نسبت به کلرامفنیکل و استرپتومایسین مقاومت نشان دادند در حالی که نسبت به تریمتوپریم- سولفامتوکسازول، اریترومایسین و نورفلوکساسین حساسیت کامل نشان داده شد (جدول شماره 5) (22).
جدول 3. درصد جداسازی لیستریا منوسیتوژنز از نمونه های مختلف کلینیکی
جدول 4. درصد فراوانی سروتیپ‌های غالب جداشده لیستریا منوسیتوژنز از نمونه‌های کلینیکی
جدول شماره 5. نتیجه حساسیت لیستریا منوسیتوژنز به 10 عامل آنتی‌بیوتیکی (اعداد به درصد هستند)
در محیط پالکام، پرگنه‌های سبز قهوه‌ای با هالۀ تیره‌رنگ و درمحیط خون‌دار، پرگنه‌های درخشان با همولیز بتا ظاهر شدند. با آزمایشات بیوشیمیایی، آنزیماتیک و آزمایش بیمایزایی روی موش انجام شد که در جدول 6 مشخص شده است.
در تعین بیماریزایی (in vivo) جدایه‌های تزریق شده به موش که پس از 72 ساعت باعث مرگ موش‌ها شد فقط تعداد 3 موش پس از 5 روز مردند. این مرگ و میر مربوط به سروتیپ‌هایی فاقد ژن iap بودند. از آنجایی که تمام سروتیپ‌ها دارای PI-PLC مثبت بودند اثرگذاری آنزیم پروتئاز A در مرگ و میر موش‌ها تایید شد. در کالبد شکافی موش‌ها از ارگان‌های طحال، کبد و روده‌های ملتهب، نمونه‌برداری و پس از بررسیهای فنوتیپی، لیستریا منوسیتوژنز جداسازی و با روش مولکولی تایید شدند.
در تعین بیماریزایی (in vivo) جدایه‌های تزریق شده به موش که پس از 72 ساعت باعث مرگ موش‌ها شد فقط تعداد 3 موش پس از 5 روز مردند. این مرگ و میر مربوط به سروتیپ‌هایی فاقد ژن iap بودند. از آنجایی که تمام سروتیپ‌ها دارای PI-PLC مثبت بودند اثرگذاری آنزیم پروتئاز A در مرگ و میر موش‌ها تایید شد. در کالبد شکافی موش‌ها از ارگان‌های طحال، کبد و روده‌های ملتهب، نمونه‌برداری و پس از بررسیهای فنوتیپی، لیستریا منوسیتوژنز جداسازی و با روش مولکولی تایید شدند.
جدول 6. نتایج آزمایشات بیوشیمیایی و API لیستریا منوسیتوژنز جدا شده از نمونه‌های سقط جنین خودبخودی
نتایج حاصل از Multiplex – PCR
از 123 بیمار مبتلا به سقط در 28 (22/76%) مورد لیستریا مونوسیتوژنز با ژن hlyA و ژن iap در 24 (19/51%) شناسایی شدند. اما از 150 نمونه زن سالم که سقط نداشتند و بارداری موفقی داشتند در 6 (4%) مورد لیستریا مونوسیتوژنز با ژن hlyA مثبت یافت شد (شکل شماره 1). مقایسه آماری فراوانی ژن hlyA در دو گروه بیمار و گروه کنترل نشان داد که اختلاف معنی‌داری بین دو گروه وجود دارد (0/0002>P). از طرفی این ژن شانس سقط (OR) را حدود 7/16 برابر در زنان افزایش می‌دهد.
مطابق جدول شماره 7، سروواریته‌های غالب a1/2 و b4 به ترتیب 50% و 35/7% و سروواریته c2 14/2% بوده است که با ارزیابی دو ژن hly و iap با روش مولتی پلکس در هر 28 مورد لیستریا منوسیتوژنز، 100% ژن hly و 24 مورد (85/71%) ژن iap مشخص گردید(شکل شماره 2) (28). همچنین تعیین توالی ژن های سروتیپ های مختلف توسط نرم افزار Blast انجام گرفت (شکل های شماره 3و 4)
از 123 بیمار مبتلا به سقط در 28 (22/76%) مورد لیستریا مونوسیتوژنز با ژن hlyA و ژن iap در 24 (19/51%) شناسایی شدند. اما از 150 نمونه زن سالم که سقط نداشتند و بارداری موفقی داشتند در 6 (4%) مورد لیستریا مونوسیتوژنز با ژن hlyA مثبت یافت شد (شکل شماره 1). مقایسه آماری فراوانی ژن hlyA در دو گروه بیمار و گروه کنترل نشان داد که اختلاف معنی‌داری بین دو گروه وجود دارد (0/0002>P). از طرفی این ژن شانس سقط (OR) را حدود 7/16 برابر در زنان افزایش می‌دهد.
مطابق جدول شماره 7، سروواریته‌های غالب a1/2 و b4 به ترتیب 50% و 35/7% و سروواریته c2 14/2% بوده است که با ارزیابی دو ژن hly و iap با روش مولتی پلکس در هر 28 مورد لیستریا منوسیتوژنز، 100% ژن hly و 24 مورد (85/71%) ژن iap مشخص گردید(شکل شماره 2) (28). همچنین تعیین توالی ژن های سروتیپ های مختلف توسط نرم افزار Blast انجام گرفت (شکل های شماره 3و 4)
شکل 1. نتایج جداسازی محصولات multiplex PCR در 5 ایزوله منتخب
چاهک M: مارکر مولکولی 100 جفت بازی، چاهک 1 و 7: نمونۀ لیستریا مثبت نمونه کنترل مثبت ( لیستریا منوسیتوژنز ATCC=7644 ) حاوی فقط باند 370 جفت باز، چاهک 2 و 3: نمونه حاوی لیستریا a2، چاهک 4 تا 6: نمونه‌های لیستریا b4، چاهک 8 نمونه لیستریا c2.
چاهک M: مارکر مولکولی 100 جفت بازی، چاهک 1 و 7: نمونۀ لیستریا مثبت نمونه کنترل مثبت ( لیستریا منوسیتوژنز ATCC=7644 ) حاوی فقط باند 370 جفت باز، چاهک 2 و 3: نمونه حاوی لیستریا a2، چاهک 4 تا 6: نمونه‌های لیستریا b4، چاهک 8 نمونه لیستریا c2.
شکل 2. نتایج جداسازی محصولات multiplex PCR در 6 نمونه منتخب: چاهک M : مارکر مولکولی 100 جفت بازی، چاهک 1 : نمونه کنترل مثبت لیستریا منوسیتوژنز، چاهک 2، 3، 4 و 6 تا 10 : نمونه لیستریا مثبت از نظر 2 ژن hlyA به اندازه 456 جفت باز و iap به اندازه 131 جفت باز، چاهک 5 و 11 : نمونه حاوی کنترل منفی ( استافیلوکوکوس اورئوس ATCC25923)
جدول 7. توزیع فراوانی سروتیپ های غالب a1/2، b4 و c2 و ژن های hlyA
شکل 3. تعیین توالی و با استفاده از نرم افزار Blast (Listeria monocytogenes hlyA)
شکل 4. تعیین توالی و با استفاده از نرم افزار Blast (Listeria monocytogenes 2c iap)
بحث
بروز لیستریوز در زنان باردار با سقط جنین‌های خودبخودی، 12 نفر از هر صد هزار نفر است در صورتی که در افراد سالم 0/07 درصد گزارش شده است (7) که طبق گزارشات، یک سوم از لیستریوزیس انسانی مربوط به سقط جنین خودبخودی بوده است و اغلب در سه ماهه دوم یا اوایل سه ماهه سوم اتفاق می افتد (7، 27). لذا بر اهمیت تشخیص این باکتری تاکید می‌شود. در این پژوهش با اخذ نمونه‌های کلینیکی از 123 بیمار سقط جنین خودبخودی که شامل 258 نمونه‌هایی از جفت جنین (118)، ترشحات واژینال (87) و خون بیمار (53) مورد بودند انجام پذیرفت.
با استفاده از روش‌های فنوتیپی و ژنوتیپی، 28 مورد (10/8%) لیستریا منوسیتوژنز که 21 مورد (17/7%) از جفت و 2 مورد(3/7%) از خون و 5 مورد (5/7%) از ترشحات واژینال، لیستریا منوسیتوژنز جدا گردید که سروتیپ‌های a1/2، 9مورد (42/8%) از جفت جنین و 2 مورد (100%) از خون و 3 مورد (60%) از ترشحات واژینال و همچنین سروتیپ b4 به ترتیب 8 مورد (38%)، صفر مورد (صفر%) و 2 مورد (40%) از ترشحات جفت جنین، خون و ترشحات واژینال شناسایی شدند. غالب بودن سروتیپ a1/2 با 14 مورد (50%) نسبت به سروتیپ b4 با 10 مورد (35/7%) مشخص گردید. همچنین 4 مورد (14/2%) سروتیپ c2 از سقط جنین‌های خودبخودی برای اولین بار در ایران گزارش و با تطبیق مشخصات فنوتیپی و ژنوتیپی با سویه‌های پراکنده که با سروتیپ‌های a1/2 و b4 از مواد غذایی در ایران گزارش شده در این بررسی مطالعه شدند. جهت ارزیابی دو ژن hly, iap که موثرترین ژن‌ها در سقط جنین‌های خود بخودی هستند از نظر ژنوتیپی مطالعه هستند. طبق یافته‌های مولکولی با روشMultiplex PCR وجود ژن hlyA در تمام سروواریته‌های غالب (100%) و ژن iap با (85/7%) در 24 مورد از سروواریته‌های غالب، بیانگر این مهم است که وجود این دو ژن در این سروتیپ‌ها باعث بروز سقط جنین‌های خودبخودی است و از نظر این که 4 مورد از سروواریته‌های a1/2 فاقد ژن iap بودند، همین مسئله باعث کاهش شدت و حدت باکتری شده و عامل مهم و موثر در تاخیر سقط جینن‌های خودبخودی بوده که از یافته‌های بسیار مهم این مطالعه است.
طبق نتایج مولتی پلکس PCR، 28 سروتیپ غالب a1/2 و b4 شناسایی که شامل 14 مورد سروتیپ a1/2، 10 مورد سروتیپ b4 و 4 مورد سروتیپ c2 بودند که همگی دارای ژن hlyA، کد کننده لیستریولیزین O بودند که عمده‌ترین و مهمترین ژن لیستریا منوسیتوژنز از نظر نشانگر ساختن جنس باکتری و سروتیپ‌های وابسته به آن و همچنین از نظر بیماریزایی است. وجود ژن iapدر تمام سروتیپ‌ها بر شدت و حدت بیماریزایی باکتری می‌افزاید و برای اولین بار، نشان داده شد. چهار سروتیپ a2/1 که فاقدژنiap بودند باعث تاخیر در سقط جنین گردیده است به طوریکه هر چهار مورد سقط، در ترم سوم حاملگی رخ داد، و مرگ و میر موش‌ها چهار هفته پس از تزریق اتفاق افتاد، همچنین می‌توان گفت امکان جهش در ژن iap به علت پلی‌مورف بودن توالی مرکزی، با پرایمرهای انتخابی پژوهش حاضر دلیل دیگری بر این امر است (28).
در مطالعه حاضر از 258 نمونه کلینیکی 28 مورد لیستریا منوسیتوژنز جدا شده که سرووارهای غالب a1/2 و b4 بودند با مطالعه دکتر Shayan و همکاران در سال 1387 بر روی 100 نمونه که عمدتا از ترشحات واژن انجام گرفته بود از نظر نسبت آماری با مطالعات نامبرده مطابقت دارد (24 (در صورتی که مطالعه کارگر و همکاران در سال 2009 شیوع لیستریا منوسیتوژنز در موارد سقط انسانی به صورت 13/1% گزارش شده است (18) در مجموع، شیوعِ بالاتر گزارش شده در مطالعات کارگر در مقایسه با پژوهش حاضر می تواند به دلیل انجام مطالعه از مناطق محروم کشور و تفاوت سطح بهداشتی درآن مناطق با تهران باشد.
در سال 2009 انجام مطالعات Jamshidi و همکاران در ارتباط با تیتر آنتی بادی لیستریا منوسیتوژنز و سقط های خودبخودی روی سرم 200 خانم باردار که درمطالعات کلینیکی احتمال سقط خودبخودی داشتند در منطقه بندر عباس انجام گرفت و عیار بالاتر از 1/400 را جهت پیش آگاهی از بروز سقط جنین‌های خودبخودی اعلام نمودند و سرووار غالب در مطالعه ایشان سروواریته b4 بود (19) در صورتی که دربررسی های پژوهش حاضر سروتیپ a1/2 به عنوان سروواریته غالب شناسایی گردید.
در سال 2013 Jamali و همکاران، لیستریا منوسیتوژنز را از مواد غذایی مختلف اعم از خام یا آماده به مصرف با استفاده از روش های باکتریولوژیکی، جداسازی و به عنوان یک عامل مخاطره انگیز جهت بهداشت انسان، بخصوص در افراد مسن و افراد با نقص سیستم ایمنی و کودکان وخانم‌های باردار معرفی کردند (20). این بررسی هم از نظر فنوتیی و هم از نظر ژنوتیپی با بررسی پژوهش حاضر مغایرت داشته ولی نمایانگر این موضوع است که لیستریا منوسیتوژنز یک باکتری مخاطره انگیز دربهداشت جامعه است.
دکتر Nematollahi و همکاران درسال 1394 در پژوهشی تحت عنوان «بررسی فراوانی لیستریا منوسیتوژنز در زنان باردار اراک» توانستند از 540 نمونه واژن و ادرار زن باردار با روش کشت، تعداد 14 مورد لیستریا منوسیتوژنز جدا کنند. 8 مورد دارای سابقه سقط و 6 مورد فاقد سقط بوده‌اند. در این پژوهش متغیر سن مد نظر بود ولی پژوهش از نظر ژنوتیپی انجام نپذیرفته بود. در این پژوهش فقط پراکندگی لیستریا منوسیتوژنز به‌عنوان یکی از عوامل سقط جنین در خانم‌ها گزارش گردیده است (29).
در سال 2009 دکتر Kargar و همکاران تعداد 428 نمونه شیر تازه را بررسی کردند و تعداد 56 نمونه (13/1%) لیستریا منوسیتوژنز را جداسازی نمودند که 91/7% از آنها با روش مولتی پلکس PCR ژن hly را شناسایی و برای اولین بار پراکندگی ژن hly را در مواد غذایی و سقط جنین از مرودشت شیراز گزارش نمودند (18). در مطالعه Kargar و همکاران به دلیل انجام پژوهش در مناطق محروم کشور و اختلاف سطح بهداشت در مقایسه با تهران، میزان شیوع بالایی از لیستریوزیس در انسان- نسبت به پژوهش ما- گزارش گردید. این پژوهش از جنبه نقش ژن hlyدر سقط با پژوهش حاضر همسانی داشته اما از جنبه تعیین سایر سروتیپ‌های لیستریا وسایر ژن های موثر مطابقت ندارد.
در سال 1396 Kalantaripour و همکاران، از تعداد 100 نمونه پنیر سنتی به صورت تصادفی جمع آوری و با استفاده از روش های متداول کشت جداسازی وشناسایی کردند. از 12 نمونه لیستریای جداشده 5 جدایه مربوط به لیستریا منوسیتوژنز و 7 نمونه جداشده مربوط به لیستریا ایوانووی بودند. ولی از نظر ژنوتیپی جهت بررسی سویه‌های غالب کار پژوهشی انجام ندادند (30).
در سال 2013 Jahangir و همکاران 311 نمونه را که شامل ادرار، خون، مایع آمنیوتیک و سواپ واژینال از 157 زن باردار اخذ شده بود از نظر لیستریا منوسیتوژنز مورد بررسی قرار دادند که هدف این مطالعه تاکید بر جداسازی ژن hly A بود که 19 نمونه اخذ شده از زنان باردار با سابقه سقط خودبخودی و 120 نمونه از خانم های باردار بدون عوارض سقط جنین تهیه گردیده بودکه با بررسیهای مولکولی نشان دادند 10/28% از افراد مورد مطالعه دارای ژن hly A بودند که عمدتا در خانمهای با علائم سقط و در سنین بین 30-26 اتفاق افتاده بود (25(. در این بررسی بدون این که سایر ژن های مداخله گر را نیز مورد مطالعه قرار دهند عمدتا ژن hlyA را به‌عنوان یک ژن تهاجمی معرفی نموده و ژن‌های موثر دیگر را مدنظر قرار نداده و غالب بودن سروتیپ‌ها نیز نامشخص مانده است. در پژوهش حاضر با شناسایی دو عامل فنوتیپی و ژنوتیپی و امکان وجود موتاسیون در ژنوتیپ‌های مورد مطالعه نکات مبهم مشخص شد.
در سال 2014 Eslami و همکاران جهت بررسی فاکتورهای ویرولانس در96 مورد سقط خودبخودی، وجود ژن‌های plcA R hly را در 16 مورد به روش PCR شناسایی کردند. میزان درصد بروز ژن hly در لیستریا منوسیتوژنز بیش از plcA بوده است (26). در این پژوهش نیز بررسی سویه‌های غالب مشخص نشده بود و دلیل انتخاب این دو ژن در سقط جنین‌های مورد مطالعه معلوم نبود. همچنین شناسایی سروتیپ‌های غالب انجام نپذیرفته بود که با مقایسه با پژوهش حاضر مغایرت داشته است.
Pournajaf و همکاران در سال 2016، تعداد 617 نمونه از موارد کلینیکی و غیر کلینیکی مشکوک به لیسیتریا منوسیتوژنز را با روش Multiplex PCR جهت ارزیابی ژن های Inl A,C,J انجام دادند که از این تعداد نمونه 46 (7/45%) مورد لیستریا منوسیتوژنز جدا نمودند و نامبردگان نشان دادند وجود این سه ژن بیانگر بیماریزایی لیستریا منوسیتوژنز است و متذکر شدند وجود یک ژن برای اثبات بیماریزایی این باکتری کافی و قابل تفسیر نیست (27). این پژوهش با پژوهش حاضر از نظر موضوع کاملا مغایرت داشته فقط بیانگر این حقیقت است که وجود چند ژن در لیستریا می‌تواند حدت بیماریزایی را افزایش داده و عوارض کلینیکی مربوط به این باکتری را بوجود بیاورد. همچنان که در پژوهش ما نقش دو ژن hly و iap مشخص گردید (28).
در سال 1392 Pournajaf و همکاران تعداد 46 (7/4%) ایزوله لیستریا منوسیتوژنز از کل 617 نمونه جمع آوری شده جدا کردند که از 170 نمونه بالینی تعداد 14(8/2%) به ترتیب 7/5%، 5/7%، 14/2%، 8/5% از جفت، ادرار، واژن و رکتال جدا شدند. در مطالعه حاضر فقط گونه لیستریا منوسیتوژنز مشخص گردید و پژوهشگران سروتایپینگ سروتیپ های شایع دخیل در لیستریوز انسانی را در مطالعات آینده پیشنهاد نمودند (31). در مطالعۀ ما تعیین سروتیپ‌های غالب و دخیل در سقط جنین‌های خودبخودی انسانی مشخص و غالب بودن a1/2 و b4 مشخص گردید و برای اولین بار سروتیپ c2 که از سقط جنین‌های خودبخودی انسانی جدا شده بود از ایران گزارش شد (28).
Kumar در سال 2015 تعداد 3700 نمونه کلینیکی از خانمهای حامله در هند جمع‌آوری و بر اساس آزمایشات سروتایپینگ، ژنوتایپینگ و بیماریزایی در شرایط in vivo مطالعه کرد که از 30 مورد (0/8%) نمونه‌ها پس از آزمایشات لازم، لیستریا منوسیتوژنز جدا گردید که اکثر سویه‌ها از سروتیپ b4 بودند و 20 مورد نمونه‌ها واجد ژن‌هایactA ,prfA, plc A, hly,InlA, inlC,InlY, iap و 6 مورد فاقد ژن‌های مذکور بودند (23). این مطالعه با اهداف اصلی پژوهش حاضر چه از نظر روش‌های فنوتیپی و چه از نظر ژنوتیپی مطابقت کامل داشته ولی غالب بودن اکثر سروتیپ‌ها و اولویت تاثیر‌گذاری ژن‌های جدا شده را مشخص ننموده است.
در سال 2017 Lotfollahi و همکاران، تعداد 442 نمونه های انسانی، دامی و غذایی را با روش مولتی پلکس PCR مطالعه کردند و سروتیپ‌های c1/2 (یا c3)،b 4، d4(یا e4) و a1/2 (یا a3) را برای اولین بار از نمونه‌های انسانی و دامی شناسایی نمودند (32) در صورتی که در مطالعه حاضر سروتیپ‌های a1/2 و b4 به عنوان سروتیپ‌های غالب شناسایی و جداسازی c1/2 از سقط جنین‌های خودبخودی برای اولین بار در ایران گزارش گردید.
به طور کلی یافته‌های حاصل از تحقیق انجام یافته نشانگر سروتیپ‌های a1/2 و b4به‌عنوان سروتیپ‌های غالب لیستریا منوسیتوژنز در سقط جنین‌های خودبخودی است و بررسیهای باکتریولوژیکی و مولکولی نشان داد که سروتیپ c2 در سقط جنین‌های خودبخودی اثرگذار و برای اولین بار در ایران گزارش شود.
سپاسگزاری
از تمامی همکارانی که در انجام این پژوهش ما را یاری رساندند، سپاسگزاریم.
تعارض منافع
بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشی |
موضوع مقاله:
باکتری شناسی پزشکی
دریافت: 1398/2/31 | پذیرش: 1398/5/19 | انتشار الکترونیک: 1398/6/24
دریافت: 1398/2/31 | پذیرش: 1398/5/19 | انتشار الکترونیک: 1398/6/24
فهرست منابع
1. Khamiri M. Vandyousefi J. Investigation of Listeria monocytogenes stability during the manufacture and storage of Iranian white cheese. Pajoohesh and Sazandegi Journal.26:15-110
2. Sadatzadeh H. 1350. Listeriosis in Iran. Journal of Medical collage of Tehran Medical Science University Tehran, Iran25:289-293
3. Ashwani K, Sunita G, Virender K. 2015.Exploring specific primers targeted against different genes for a multiplex PCR for detection of Listeria monocytogenes. Biotech Jun, 5(3):265-269 [DOI:10.1007/s13205-014-0225-x] [PMID] [PMCID]
4. Mead P. S, L. Slutsker, Slutsker L., Dietz V, Mc Caig LF., Bresee JS. Shapiro C. Griffin PM. Tauxe RV. 1999. Food-related illness and death in the United States.Emerg. Infect Dis.5:607-25 [DOI:10.3201/eid0505.990502] [PMID] [PMCID]
5. Vandyousefi J.1990.Listeriosis in Iran.International Congress for infection disease. July15-19p:195
6. Jose A. Vazquez -B, Emilia K, Mariela S. 2017.Listeria placental infection. American Society for Microbioligy.8(3):949-57
7. Kaur S, Malik SVS, Bhilegaonkar KN, Veidya VN. Barbuddhe SB. 2007. In spontaneous abortion in human and its detection by Multiplex PCR. J Appl.Microbiol,20:145-52
8. Hudson JA. 1992. Efficacy of high sodium chloride concentration for the destruction Listeria monocytogenes. Lett Appl Microbiol.,14:178-180 [DOI:10.1111/j.1472-765X.1992.tb00678.x]
9. Low JC and Donachie W. 1997. A review of Listeria monocytogenes and listeriosis Vet J 153:9-29 [DOI:10.1016/S1090-0233(97)80005-6]
10. Schmid M. Walcher M, Bubert A, Wagner M, Schleifer KH. Nucleic acid bases, cultivation in depended detection of Listeria spp. And genotypes of Listeria monocytogenes. Immun. Medical Microb. 2003,35:215-225 [DOI:10.1016/S0928-8244(02)00456-X]
11. Winkhaus-Schindle I, Seeliger HP, etal. Listeriosis as a conformed in several patients with Habitual abortios. Geburtshilfe Frauenheilkd. 2004,26:137-9
12. Sadeghi B, Pournajaf P. etal. Genotypic characterization invasion index and antimicrobial resistance pattern in Listeria monocytogenes strains isolated from clinical samples.2015, Journal of Accute Disease.141-146 [DOI:10.1016/S2221-6189(15)30024-X]
13. Kalekar S. Rodrigues J. Costa DD. Doijad S. Ashok kumar J. etal. 2016. Genotypic characterization of Listeria monocytogenes isolated from humans in India.Ann Trop Med Parasitol 105(5):351-358 [DOI:10.1179/1364859411Y.0000000023] [PMID] [PMCID]
14. Dongyou L, Lawrence L, W. Austin F, Ainsworth A. A multiplex PCR for species determination of Listeria monocytogenes.2007Journal of Microbiological Methods,17:133-140 [DOI:10.1016/j.mimet.2007.08.007] [PMID]
15. Monica K, Borucki R. 2003. Listeria monocytogenes serotype identification by PCR. J. Clinic. Microbiol,5537-5540 [DOI:10.1128/JCM.41.12.5537-5540.2003] [PMID] [PMCID]
16. Setiani B.E, Elegado F.B, Perez MTM, Mabesa RC, Dizon EI, Sevilla CC.2015. API Listeria rapid kit for confirmatory phenotypic conventional biochemical test of the prevalence Listeria monocytogenes in selected meat and meat products, PROCEDIA Food Science. 3:445-52 [DOI:10.1016/j.profoo.2015.01.049]
17. Zilma das Graças Nunes; Ernesto Hofer.1994. Evaluation of phenotypic markers associated with pathogenicity in the genus Listeria. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo vol.36 no.4 [DOI:10.1590/S0036-46651994000400001] [PMID]
18. Kargar M, Ghasemi. A.2009. Role of Listeria monocytogenes hlyA gene isolated from fresh cheese in human habitual abortion in Marvdasht. J. Clinic Infect Dis. 4(4):214-8
19. Jamshidi M. Sotoodeh J. 2009. Seropositivity for Listeri amojnocytogenes in women with spontaneous abortion, A case control study in Iran. Tiwan Jopstet Gynecol. Vol8(1):46-48 [DOI:10.1016/S1028-4559(09)60034-6]
20. Jamali H. Chai L.C 2013.Detection and isolation of Listeria spp and Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods with various selective culture media. Food Contr32:19-24 [DOI:10.1016/j.foodcont.2012.11.033]
21. Nowroozi J. Moradi bidhendi S. Shafiee M.2013. detection of acta gene in listeria monocytogenes isolated from dairy products. Journal of microbial world 6, Number 3 (16); Page(s) 246 To 252.
22. Lotfollahi L. Nowroozi J. 2011. Prevalence and antimicrobial resistence profiles of Listeria monocytogenes in spontaneous abortions in humans. African Journal of Microbiology Research, 5(14):1990-93 [DOI:10.5897/AJMR11.498]
23. Kumar D. Singh DV. Dubey SK.2015. Pregnancy-associated human Listeriosis: Virulence and genotypic analysis of Listeria monocytogenes from clinical samples. Journal of Microbiology 53(9):653-660 [DOI:10.1007/s12275-015-5243-9] [PMID]
24. Shayan R. Sattari M. Forouzandeh M. 1388. Identification of Listeria monocytogenes in vaginal samples by PCR. Medical Journal of Modares.12:51-58
25. Jahangir. A Kargar M. 2013 "Assesing Listeria monocytogenes hly A genes in pregnant women with spontaneous abortion using PCR method in Yasouj South west of Iran" African Journal of microbiology research.vol.7(33):4257-60
26. Eslami G. Gudarzi H.2014June. "Identification of Listeria monocytogenes virulence factors in women with abortion by PCR." Arch clin infect dis 9(3): e199 [DOI:10.5812/archcid.19931]
27. Pournajaf A. Rajabnia R. Sedighi M.2016.Prevalence and virulence determination of Listeria monocytogenes strains isolated from clinical and non-clinical samples by multiplex-PCR.Rev Soc Bros Med Tropi.49(5):6024-27 [DOI:10.1590/0037-8682-0403-2015] [PMID]
28. Rezaei M. Kazemipour N. Vandyousefi J, Rokhbakhsh zamin F. Irajian G.2018. Determination of dominant serovars of Listeria monocytogenes strains isolated from spontaneous human abortion in Tehran, Iran. EurAsian Journal of Bioscience, (12):377-83 [DOI:10.18502/ijml.v5i4.158]
29. Nematollahi S, Ghaznavi E. Zamani A.2016.Studing the prevalence of Listeria monocytogenes in pregnant women in Arak. Arak medical university journal,18(105):44-50
30. Kalantaripour A. Hanifian Sh.1396. Listaria isolated from traditional cheese of Tabriz area: Occurrence, diversity and phenotypic characteristics.3:83-96
31. Pournajaf A. LotfollahI L. Irajian G. Ardebili A. Sadeghi B. Taghizadeh M. Prevalence of Listeria monocytogenes strains isolated from clinical and non-clinical samples by phenotypic and multiplex-PCR1392. Iranian Journal Medical Microbiology:7(2): p14-19
32. Lotfollahi L. Chaharbalesh A. Ahangarzade rezaee M. Hasani A.2017.Prevalence antimicrobial susceptibility and multiplex-PCR serotyping of Liusteria monocytogenes isolated from humans, foods and livestock in Iran. Microbial pathogenesis.107:425-429 [DOI:10.1016/j.micpath.2017.04.029] [PMID]
33. Bubade S. warke S. Karoley D.2016.Virulence gene profiling and serotyping of Listeria monocytogenes from infertility cases from women. International journal of health science and research. vol6:440-449
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
