سال 13، شماره 2 - ( خرداد - تیر 1398 )                   جلد 13 شماره 2 صفحات 137-141 | برگشت به فهرست نسخه ها


XML English Abstract Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Yousefi E, Ghouchannezhad Nournia B, Yousefi A, Fakour F. Identification of Escherichia coli O157: H7 from Slaughtered Beef in Mashhad Using Biochemical and Molecular Methods. Iran J Med Microbiol. 2019; 13 (2) :137-141
URL: http://ijmm.ir/article-1-931-fa.html
یوسفی احسان، قوچان نژاد نورنیا بهاره، یوسفی افسانه، فکور فائزه. شناسایی اشریشیاکلی O157:H7 درگوشت گاوهای کشتار شده شهر مشهد با استفاده از روش های بیوشیمیایی و مولکولی . مجله میکروب شناسی پزشکی ایران. 1398; 13 (2) :137-141

URL: http://ijmm.ir/article-1-931-fa.html


1- گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه آزاد اسلامی، مشهد، ایران
2- گروه اگروتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی، مشهد، ایران
3- گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه آزاد اسلامی، مشهد، ایران ، faezefakour@gmail.com
متن کامل [PDF 757 kb]   (952 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (3109 مشاهده)
متن کامل:   (1283 مشاهده)
مقدمه

 اﺷﺮیﺸﯿﺎ ﮐﻠﯽ ﺗﻮﻟﯿﺪﮐﻨﻨﺪه وروﺗﻮﮐﺴﯿﻦ از ﻣﻬﻢ‌ﺗﺮیﻦ باکتری‌های پاتوژن اﻧﺴﺎﻧﯽ است. اشریشیا کلی سویه O157:H7 مهم‌ترین سروتیپ پاتوژن ایﻦ ﭘﺎﺗﻮﺗیﭗ در اﻧﺴﺎن است و یکی از عوامل اصلی ایجاد‌کننده بیماری­ های منتقل‌شونده به­ وسیله مواد غذایی از جمله گوشت و فرآورده­ های گوشتی است (1،2) که در ایجاد بیماری­ هایی همچون ﻛﻮﻟﻴﺖ ﺧﻮﻧﺮﻳﺰی دﻫﻨﺪه، ﭘﻮرﭘﻮرا ﺗﺮوﻣﺒﻮﺳﻴﺘﻮﭘﻨﻲ اﻳﺪﻳﻮﭘﺎﺗﻴﻚ و ﺳﻨﺪروم اورﻣﻲ ﻫﻤﻮﻟﻴﺘﻴﻚ مؤثر است (3). اشریشیا کلی سویه O157:H7، کودکان و سالمندان را بیشتر درگیر می­ کند و بیماری­ های ناشی از آن از ﻛﺸﻮرﻫﺎی زﻳﺎدی از ﺟﻤﻠﻪ آمریکا، انگلستان و دﻳﮕﺮ ﻛﺸﻮرﻫﺎی ﺗﻮﺳﻌﻪ ﻳﺎﻓﺘﻪ و در ﺣﺎل ﺗﻮﺳﻌﻪ (4، 5) و همچنین عفونت ادراری ناشی از این پاتوژن در ایران (شهرستان الشتر) گزارش شده است (6). اولویت تحقیقاتی پیشنهاد شده از طرف سازمان جهانی بهداشت به تمامی کشورهای جهان به ویژه کشورهای در حال توسعه، پایش باکتری اشریشیا کلی سویه O157:H7 است. در این سویه از اشریشیا کلی، ژن رمزدهی‌کننده آنتی­ژن O157 در کلاستر 12ژنی قرار دارد. از مجموع این 12 ژن، یک گروه 6 ژنی مسئول بیوسنتز قند-باز است و پروتئین رمزدهی شده توسط ژن rfbE نیز در همین گروه قرار دارد (7). rfbE یک ژن اختصاصی است که منحصراً در ژنوم سروتیپ O157:H7 وجود دارد و آنتی­ژن سطحی O را رمزدهی می­کند که به فرآیند شناسایی صحیح پاتوژن مذکور از طریق تکنیک PCR کمک می­ کند (8). با توجه به دوز عفونی بسیار پایین باکتری اشریشیا کلی سویه O157:H7 (9)، ﺷﻨﺎﺳﺎﻳﻲ ﻣﻨﺎﺑﻊ ﻋﻔﻮﻧﻲ و پایش مستمر مواد غذایی به ویژه گوشت و فرآورده­ های گوشتی در کشور حائز اهمیت است. از آنجا که در بین حیوانات، گاو به عنوان مهم­ترین مخزن این سویه از اشریشیا کلی است (10)، بر آن شدیم تا پژوهشی در جهت پیشبرد اهداف سازمان جهانی بهداشت انجام دهیم. مطالعه حاضر اولین گزارش از وضعیت آلودگی گوشت گاوهای کشتار شده در کشتارگاه شهرستان مشهد به اشریشیا کلی سویه O157:H7 است که خود می­ تواند به عنوان نوآوری این پژوهش باشد. هدف از انجام این تحقیق، بررسی شیوع آلودگی گوشت گاو کشتار شده در مشهد به اشریشیا کلی سویه O157:H7 با روش­های بیوشیمیایی و مولکولی (ردیابی ژن rfbE) بود.

 
مواد و روش ها

جداسازی و شناسایی بیوشیمیایی اشریشیا کلی و اشریشیا کلی سویه O157:H7 از گوشت گاو کشتار شده
در این مطالعه توصیفی-تحلیلی، از ناحیه عضلات سطحی گردن لاشه گاو کشتار شده در مشهد و بر اساس مطالعات مشابه (11،12)، 30، 45، 42 و 31 نمونه (با اندازه برش­ های 10×10× 0/3 سانتی­متر) به ترتیب در فصول بهار، تابستان، پاییز و زمستان سال 1397 به طور تصادفی جمع­ آوری (در مجموع 148 نمونه) و در شرایط استریل و در کنار کیسه یخ به آزمایشگاه منتقل شد. آزمایش­ های مربوط به جداسازی و شناسایی اشریشیا کلی و اشریشیا کلی سویه O157:H7، حداکثر تا 10 ساعت پس از نمونه­ گیری انجام شد. به منظور جدا کردن اشریشیا کلی و اشریشیا کلی سویه O157:H7، 25 گرم از هر نمونه به صورت هموژن شده به 225 میلی­ لیتر محیط کشت تریپتون سوی براث (TSB) (Merck, Germany) غنی شده با نووبیوسین (20 میلی­ گرم در لیتر) اضافه و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه  سلسیوس انکوبه شد. برای جداسازی اشریشیا ﻛﻠﻲ، پس از گرماگذاری، یک لوپ از نمونه غنی شده، به روش کشت خطی روی پلیت حاوی محیط کشت ائوزین متیلن بلو آگار (EMB) کشت شد و به مدت 24 ساعت در گرم­ خانه با دمای 37 درجه سلسیوس قرار داده شد. سپس، از ﻛﺸﺖ روی ﻣﺤﻴﻂ تریپل شوگر آیرون آگار (TSI) (Merck, Germany) و آزمون IMViC استفاده شد. کلنی­ هایی که در محیط TSI از نظر تخمیر قندها به صورت اسید/اسید، H2S (تولید سولفید هیدروژن) منفی و توانایی تولید گاز را داشتند و همچنین از نظر آزمون IMViC به صورت اندول مثبت، متیل­رد مثبت، وگس پروسکوئر منفی و سیتراتاز منفی بودند، به عنوان اشریشیا کلی محسوب شدند. برای جداسازی اشریشیا کلی سویه O157:H7، یک لوپ از نمونه غنی شده، به روش کشت خطی روی پلیت حاوی محیط کشت سوربیتول مک کانگی آگار (SMA) (Merck, Germany) حاوی سفیکسیم (0/5 میلی ­گرم در لیتر) و تلوریت پتاسیم (2/5 میلی­ گرم در لیتر) کشت و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه  سلسیوس انکوبه شد. کلنی ­های سوربیتول منفی به عنوان اشریشیا کلی سویه O157:H7 در نظر گرفته شدند (12).

شناسایی مولکولی اشریشیا کلی سویه O157:H7
برای تأیید این سویه از باکتری اشریشیا کلی از روش کلنی PCR (Polymerase Chain Reaction) و آغازگرهای ژن rfbE (Sinaclone, Iran) استفاده شد (جدول 1).

 
جدول 1. مشخصات آغازگرهای مورد استفاده برای ردیابی ژن rfbE در ایزوله­ های اشریشیا کلی سویه O157:H7 گوشت گاو کشتار شده


مخلوط واکنش کلنی PCR با حجم نهایی 25 میکرولیتر حاوی 1 کلنی اشریشیا کلی سویه O157:H7، 1 میکرولیتر از هر یک از آغازگرهای پیشرو و پیرو (Pmol/μL 5)، 2/5 میکرولیتر بافر (X10)، 1 میکرولیتر dNTP (mM 0/2)، 0/75 میکرولیتر MgCl2 (mM 0/8)، 0/75 میکرولیتر Taq DNA پلیمراز (unit/μL 1) و 17 میکرولیتر آب مقطر آماده شد. کلنی PCR با استفاده از ترموسایکلر (Kyratec, Korea) و مطابق با چرخه­های دمایی زیر، در 30 سیکل انجام شد.
واسرشتی اولیه در دمای 94 درجه سلسیوس به مدت دقیقه، واسرشت ثانویه در دمای 94 درجه سلسیوس به مدت 0/75 دقیقه، اتصال در دمای 57 درجه سلسیوس به مدت 0/75 دقیقه، بسپارش در دمای 72 درجه سلسیوس به مدت 0/75 دقیقه و بسپارش نهایی در دمای 72 درجه سلسیوس به مدت 10 دقیقه انجام شد. محصولات واکنش کلنی PCR روی ژل آگارز 1/5 درصد حاوی اتیدیوم بروماید (CinnaGen, Iran) به مدت 30 دقیقه با ولتاژ 70 ولت الکتروفورز (Interlab, Italy) شدند. سپس نمونه ­های رانده شده در ژل با استفاده از دستگاه فرابنفش لامیناتور مشاهده شدند. در نهایت از باندها با استفاده از دستگاه ژل داک (Kimiagene, Iran) عکس گرفته شد (13). از اشریشیا کلی سویه O157:H7 با شماره استاندارد 933J و آب مقطر به ترتیب به عنوان کنترل مثبت و کنترل منفی استفاده شد.


 
بحث و یافته ها

جداسازی و شناسایی صحیح، نقش مهمی در درمان آسیب­ های ناشی از پاتوژن­ ها دارد. روش­ های بیوشیمیایی می­ توانند ما را در دستیابی به این مهم یاری کنند؛ اما این روش­ ها زمانبر هستند و وجود خطا در کشت­ های افتراقی غیر قابل انکار است. امروزه با پیشرفت روش­ های مولکولی همچون PCR، قابلیت شناسایی یک پاتوژن در سطح سویه و سروتیپ و همچنین در دزهای بسیار پایین فراهم شده که این پدیده در زمینه بهبود کیفیت بهداشت عمومی بسیار امیدوار‌ کننده است. با توجه به جایگاه ویژه­ای که پاتوژن اشریشیا کلی سویه O157:H7 در ایجاد عفونت­ ها دارد، ما را بر آن داشت تا در این پژوهش، به ارائه راهکاری سریع و منطقی در شناسایی این پاتوژن بپردازیم؛ دلیل انتخاب و ردیابی ژن rfbE، اختصاصی بودن آن برای اشریشیا کلی سویه O157:H7 بود. براساس آزمون­ های بیوشیمیایی 46 نمونه (31/08 درصد) از مجموع نمونه­ های مورد مطالعه آلوده به اشریشیا کلی و از این تعداد 7 نمونه (4/73 درصد) بر اﺳﺎس وﻳﮋﮔﻲ ﻋﺪم ﺗﺨﻤﻴﺮ ﺳﻮرﺑﻴﺘﻮل ﺑﻪ ﻋﻨﻮان سروتیپ مشکوک به اشریشیا کلی سویه O157:H7 بودند. نتایج کلنی PCR ژن rfbE مربوط به 7 جدایه مشکوک به اشریشیا کلی O157:H7، 2 جدایه را به عنوان اشریشیا کلی سویه O157:H7 تأیید کرد که حاکی از آلودگی 1/35 درصد گوشت گاوهای کشتار شده در مشهد به اشریشیا کلی سویه O157:H7 بود. این مقدار، از آلودگی گوشت گاوهای کشتار شده در اصفهان به این باکتری با 6/4 درصد، گزارش شده توسط Rahimi و همکاران در سال 2008 کمتر بود (12). در تحقیقات جداگانه، میزان آلودگی گوشت گاوهای کشتار شده به اشریشیا کلی سویه O157:H7 در کشورهای انگلیس (سال 2000) و آمریکا (سال 2001) به ترتیب 13/4 و 18 درصد بود که از میزان اندازه­ گیری شده در تحقیق حاضر بسیار بیشتر است (4، 5). تفاوت در میزان شیوع گوشت گاوهای کشتار شده به اشریشیا کلی سویه O157:H7 در این تحقیق با سایر تحقیقات، می­ تواند به دلیل تفاوت در روش نمونه­ برداری، اندازه قطعات و تعداد نمونه­ ها باشد. در پژوهشی که Fode-Vaughan و همکاران در سال 2003 (14) و Campbell و همکاران در سال 2001 (15) برای شناسایی مولکولی اشریشیا کلی سویه O157:H7 انجام دادند، همانند مطالعه حاضر از ردیابی ژن rfbE استفاده کردند. در مطالعه حاضر، 7 نمونه (4/73 درصد) بر اساس ویژگی عدم تخمیر سوربیتول به عنوان سروتیپ مشکوک اشریشیا کلی سویه O157:H7 جداسازی شدند؛ این در حالی است که از این 7 نمونه (4/73)، تنها 2 نمونه (1/35 درصد) با روش کلنی PCR تأیید شدند. این امر نشان‌دهنده اهمیت روش­ های مولکولی در تشخیص صحیح این پاتوژن است. در شکل 1، جدایه­ های تأیید شده در کنار نشانگر 100 جفت ­بازی نشان داده شده است.

شکل 1. ژل الکتروفورز محصول کلنی PCR بعد از تکثیر ژن rfbE جدایه­ های اشریشیا کلی سویه O157:H7 (1 و 2: جدایه ­ها)

در این تحقیق ارجحیت روش مولکولی به بیوشیمیایی در تشخیص اشریشیا کلی سویه O157:H7 ثابت شد. با توجه به اینکه 1/35 درصد گوشت گاوهای کشتار شده در مشهد آلوده به اشریشیا کلی سویه O157:H7 بود، می­ توان استنباط کرد که گوشت گاو می­ تواند به عنوان یک مخزن اصلی و مهم برای اشریشیا کلی سویه O157:H7 مطرح باشد و احتمال انتقال این پاتوژن به انسان با مصرف گوشت گاو و فرآورده­ های آن وجود دارد. بر همین اساس و به دلیل اهمیت موضوع، ضروری است که مطالعات در زمینه مقاومت­ های آنتی­بیوتیکی، راه­ های انتقال این پاتوژن به انسان و کنترل شیوع آن در شهرستان مشهد افزایش یابد. نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد پرایمرهای اختصاصی ژن rfbE به‌خوبی قادر به افتراق کلنی­ های اشریشیا کلی سویه O157:H7 از سایر کلنی­ های رشد یافته روی محیط کشت طی فرآیند PCR هستند.

 
سپاسگزاری

از تمامی افراد و ارگان­ هایی که در انجام این تحقیق به ما یاری رساندند، کمال تشکر و قدردانی را داریم.

 
تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

 
نوع مطالعه: پژوهشي | موضوع مقاله: میکروبیولوژی مواد غذایی
دریافت: 1398/2/19 | پذیرش: 1398/5/14 | انتشار الکترونیک: 1398/6/24

فهرست منابع
1. Hiko A, Asrat D, Zewde G. Occurrence of Escherichia coli O157:H7 in retail raw meat products in Ethiopia. J Infect Dev Countries. 2008; 2(5):389-93. [DOI:10.3855/jidc.203]
2. Johnson-Henry KC, Donato KA, Shen-Tu G, Gordanpour, MandSherman P M. Lactobacillus rhamnosus strain GG prevents Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7-induced changes in epithelial barrier function. Infect Immun. 2008; 76(4):1340-48. [DOI:10.1128/IAI.00778-07] [PMID] [PMCID]
3. Vimont A, Vernozy-Rozand C, Montet MP, Lazizzera C, Bavai C, Delignette-Muller ML. Modeling and predicting the simultaneous growth of Escherichia coli O157:H7 and ground beef background microflora for various enrichment protocols. Appl Environ Microbiol. 2006; 72(1):261-8. [DOI:10.1128/AEM.72.1.261-268.2006] [PMID] [PMCID]
4. Elder RO, Keen JE, Siragusa GR, Barkocy-Gallagher GA, Koohmaraie M, Laegreid WW. Correlation of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157 prevalence in faeces, hides and carcasses of beef cattle during processing. PNAS. 2000; 97:2999-3003. [DOI:10.1073/pnas.97.7.2999] [PMID]
5. Heuvelink AE, Zwartkruis-Nahuis JTM, Beumer RR, De Boer E. Occurrence and survival of verocytotoxin-producing Escherichia coli O157 in meats obtained from retail outlets in The Netherlands. J Food Prot. 1999; 62(10):1115-22. [DOI:10.4315/0362-028X-62.10.1115] [PMID]
6. Adeli Z, Firoozeh F, Zibaei M, Shakib P. Prevalence of Shiga toxin and Intimine genes in Shiga toxin-producing Escherichia coli isolated from urine samples in Lorestan, Iran. Feyz. 2013; 17(2):188-94.
7. Tarr PI, Schoening LM, Yea YL, Ward TR, Jelacic S, Whittam TS. Acquisition of the rfb-gnd Cluster in Evolution of Escherichia coli O55 and O157. J Bacteriol. 2000; 182(21):6183-91. [DOI:10.1128/JB.182.21.6183-6191.2000] [PMID] [PMCID]
8. Tarr PI, Schoening LM, Yea YL, Ward TR, Jelacic S, Whittam TS. Acquisition of the rfb-gnd cluster in evolution of Escherichia coli O55 and O157. J Bacteriol. 2000; 182(21):6183-91. [DOI:10.1128/JB.182.21.6183-6191.2000] [PMID] [PMCID]
9. Byrne CM, Erol I, Call JE, Kaspar CW, Buege DR, Hiemke CJ, et al. Characterization of Escherichia coli O157:H7 from downer and healthy dairy cattle in the upper Midwest region of the United States. Appl Environ Microbiol. 2003; 69(8):4683-8. [DOI:10.1128/AEM.69.8.4683-4688.2003] [PMID] [PMCID]
10. Murphy BP, McCabe E, Murphy M, Buckley JF, Crowley D, Fanning S, et al. Longitudinal Study of Two Irish Dairy Herds: Low Numbers of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli O157 and O26 Super-Shedders Identified. Front Microbiol. 2016; 7:1850. [DOI:10.3389/fmicb.2016.01850] [PMID] [PMCID]
11. Shekarfroush S, Tahamtan Y, Pourbakhsh A. Detection and frequency of Stx2 gene in Escherichia coli O157 and O157:H7 strains isolated from sheep carcasses in Shiraz-Iran. Pak J Biol Sci. 2008; 11(8):1085-92. [DOI:10.3923/pjbs.2008.1085.1092] [PMID]
12. Rahimi E, Momtaz H, Hemmatzadeh F. The prevalence of Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes and Campylobacter spp. on bovine carcasses in Isfahan, Iran. IJVR. 2008; 9(4):365-70.
13. Mousavi SL, Rasooli I, Nazarian S, Amani J. Simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, toxigenic Vibrio cholerae, and Salmonella typhimurium by multiplex PCR. IJCID. 2009; 4(2):97-103.
14. Fode-Vaughan KA, Maki JS, Benson JA, Collins ML. Direct PCR detection of Escherichia coli O157: H7. Lett Appl Microbiol. 2003; 37(3):239-43. [DOI:10.1046/j.1472-765X.2003.01386.x] [PMID]
15. Campbell GR, Prosser J, Glover A, Killham K. Detection of Escherichia coli O157:H7 in soil and water using multiplex PCR. J Appl Microbiol. 2001; 91(6):1004-10. [DOI:10.1046/j.1365-2672.2001.01465.x] [PMID]

ارسال نظر درباره این مقاله : نام کاربری یا پست الکترونیک شما:
CAPTCHA

ارسال پیام به نویسنده مسئول


بازنشر اطلاعات
Creative Commons License این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است.

کلیه حقوق این وب سایت متعلق به مجله میکروب شناسی پزشکی ایران می باشد.

طراحی و برنامه نویسی : یکتاوب افزار شرق   ناشر: موسسه فرنام

© 2021 CC BY-NC 4.0 | Iranian Journal of Medical Microbiology

Designed & Developed by : Yektaweb Publishr: Farname Inc.