سال 12، شماره 6 - ( بهمن-اسفند 1397 )                   جلد 12 شماره 6 صفحات 371-381 | برگشت به فهرست نسخه ها


XML English Abstract Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Dadgar T, Vahedi Z, Yazdansetad S, Kiaei E, Asaadi H. Phenotypic Investigation of Biofilm Formation and the Prevalence of icaA and icaD Genes in Staphylococcus epidermidis Isolates . Iran J Med Microbiol. 2019; 12 (6) :371-381
URL: http://ijmm.ir/article-1-894-fa.html
دادگر تینا، واحدی زهرا، یزدان ستاد سجاد، کیایی الهه، اسعدی هانیه. ارزیابی فنوتیپی تشکیل بیوفیلم و تعیین حضور ژن‌های icaA و icaD در جدایه‌های بالینی استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس . مجله میکروب شناسی پزشکی ایران. 1397; 12 (6) :371-381

URL: http://ijmm.ir/article-1-894-fa.html


1- گروه زیست‌شناسی، واحدگرگان، دانشگاه آزاد اسلامی، گرگان، ایران ، dadgar_teena@yahoo.com
2- گروه زیست‌شناسی، واحدگرگان، دانشگاه آزاد اسلامی، گرگان، ایران
3- گروه میکروب‌شناسی، دانشکدۀ پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی گلستان، گرگان، ایران
4- باشگاه پژوهشگران جوان، واحدگرگان، دانشگاه آزاداسلامی، گرگان، ایران
5- گروه میکروب‌شناسی و انگل‌شناسی، دانشکدۀ پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی بوشهر، بوشهر، ایران
متن کامل [PDF 1001 kb]   (821 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (2897 مشاهده)
متن کامل:   (281 مشاهده)

مقدمه

استافیلوکوک‌های کواگولاز منفی (CoNS) فراوان‌ترین فلور میکروبی و غیربیماری‌زای ساکن پوست و غشاهای مخاطی هستند که تحت شرایط خاصی می‌توانند باعث ایجاد بیماری به‌ویژه در بیماران نقص ایمنی شوند. استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس غالب‌ترین گونه از استافیلوکوک‌های کواگولاز منفی در ارتباط با عفونت‌های حاصل از سوندگذاری، جراحی مفصل، پروتز و عفونت‌های بیمارستانی است. عامل مهم و کلیدی در بیماری‌زایی این‌ گونه، کلونیزه‌شدن و تشکیل بیوفیلم چندلایه است. بیوفیلم، ساختاری متشکل از جمعیت باکتریایی است که به‌وسیلۀ ماتریکس پلی‌ساکاریدی باکتری‌ها محصور شده است و به‌علت داشتن ویژگی‌های خاص فیزیولوژی و ساختاری، باعث مقاومت به بسیاری از آنتی‌بیوتیک‌ها و مکانیسم‌های دفاعی میزبان می‌شود (1). تشکیل بیوفیلم در دو مرحله انجام می‌شود: اتصال اولیۀ استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس به ماتریکس پروتئینی که در وسایل پزشکی به ‌کار گرفته ‌شده و سپس انباشته‌شدن باکتری‌ها در لایه‌های مختلف و تشکیل گلیکوکالیکس که منجر به تشکیل بیوفیلم بالغ می‌شود. پلی‌ساکارید خارج سلولیPIA) ) به‌عنوان عامل اصلی در اتصالات بین سلولی به‌منظور تشکیل بیوفیلم چندلایۀ استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس شناخته شده ‌است. PIA از طریق محصولات ژن لوکوس icaADBC تولید می‌شود که از بین آنها، icaA و icaD به‌علت فعالیت آنزیمی (N استیل گلوکزآمین ترانسفراز) نقش مهم‌تری در تشکیل بیوفیلم ناشی از این باکتری دارند (2). براساس گزارش‌ها، مقاومت باکتریایی در فاز بیوفیلم 1000 بار بیشتر از حالت پلانکتونی یا رشد آزاد همان باکتری است. چندین مکانیسم در ایجاد این مقاومت نقش دارند. اولین مکانیسم مربوط به ماتریکس پلی‌ساکاریدی است که با ایجاد یک سد فیزیکیوشیمیایی مانع از نفوذ آنتی‌بیوتیک‌ها می‌شود (3). دومین فرضیه در رابطه با مقاومت باکتریایی در مرحلۀ بیوفیلمی، مربوط به سطح پایین فعالیت متابولیکی باکتری‌ها در بیوفیلم است. از آنجایی که در قسمت‌های عمقی بیوفیلم مواد مغذی و اکسیژن به مقدار کمتری در دسترس باکتری قرار می‌گیرد، تکثیر و رشد باکتریایی متوقف می‌شود یا در سطح پایینی انجام می‌گیرد که این حالت باعث ایجاد مقاومت نسبت به آنتی‌بیوتیک‌ها می‌شود؛ زیرا اغلب آنتی‌بیوتیک‌ها زمانی عمل می‌کنند که باکتری در فاز رشد و تقسیم باشد (4). فرضیۀ سوم ایجاد یک محیط شیمیایی تغییریافته درون بیوفیلم است؛ مثلا تولید محصولات اسیدی در بیوفیلم ممکن است با تغییر pH در فضای داخلی بیوفیلم همراه بوده و باعث تغییر در عملکرد آنتی‌بیوتیک شود (5، 6). روش‌های مختلفی برای بررسی توانایی تشکیل بیوفیلم توسط استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس وجود دارد که شامل روش‌های کیفی لوله‌ای (Tube method)، کنگورد آگار پلیت (Congo Red Agar) و روش کمّی میکروتیتر پلیت (Micro titer plates) که روش استاندارد طلایی برای تولید بیوفیلم است (9-7). به‌تازگی روش‌های مولکولی مانند PCR برای بررسی و شناخت عوامل ژنتیکی دخیل در تشکیل بیوفیلم استفاده شده است. هدف از این بررسی حضور ژن‌های icaA و icaD در سویه‌های استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس تشکیل‌دهندۀ بیوفیلم و مقایسۀ روش‌های فنوتیپی TM، CRA و TCP برای تشخیص و بررسی توانایی تشکیل بیوفیلم در سویه‌های جداشده از بیماران و افراد ناقل سالم در گرگان انجام شد.

مواد و روش‌ها

جمع‌آوری و شناسایی سویه‌های باکتریایی
تعداد 90 نمونه استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس، شامل 40 نمونه سواپ بینی از افراد سالم و 50 نمونۀ کلینیکی شامل عفونت‌های خون، چشم و ادرار از بیمارستان‌ها، مراکز آموزشی ـ درمانی و آزمایشگاه‌های تشخیص طبی شهرستان گرگان از اسفندماه 1394 تا خردادماه 1395 جمع‌آوری و در محیط مانیتول سالت آگار (شرکت مرک، آلمان) کشت داده و به‌مدت 24 ساعت در گرمخانۀ 37 درجۀ سلسیوس قرار داده شدند. کلنی‌های سفیدرنگ و مانیتول منفی برای بررسی‌های بیشتر خالص‌سازی شدند. تمام نمونه‌ها از لحاظ موفولوژی در رنگ‌آمیزی گرم و آزمون‌های بیوشیمیایی افتراقی آزمایشگاهی از جمله کاتالاز، اکسیداز، کواگولاز، اوره و حساسیت به نووبیوسین مورد بررسی قرار گرفتند. در تمام آزمایش‌ها سویۀ استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس ATCC 35984 به‌عنوان کنترل مثبت تشکیل‌دهندۀ بیوفیلم و استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس ATCC 12228 به‌عنوان کنترل منفی استفاده شدند.

بررسی فنوتیپی تولید بیوفیلم در جدایه‌های استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس
برای بررسی توانایی تشکیل بیوفیلم سویه‌ها از دو روش کیفی لوله‌ای (TM) و کنگورد آگار پلیت (CRA plate) و روش کمّی صفحۀ کشت بافتTCP) ) استفاده شد.

روش لوله‌ای
در این روش یک لوپ پر باکتری از کشت 24ساعته باکتری در محیط تریپتیکاز سوی براث حاوی 1درصد گلوکز تلقیح و به‌مدت 24 ساعت در دمای 37 درجۀ سلسیوس گرماگذاری شد. سپس محتویات داخل لوله‌ها دور ریخته شده و با بافر نمکی فسفات ) (PBS)3: (pHشست‌وشو یافتند. پس از خشک‌شدن لوله‌ها در محیط آزمایشگاه، آنها با کریستال ویوله 0/1درصد به‌مدت 20 دقیقه رنگ‌آمیزی شدند. سپس لوله‌ها چندین بار با آب‌مقطر شست‌وشو داده شدند. تشکیل بیوفیلم به‌صورت یک لایۀ رنگ‌گرفته روی سطح داخلی دیوارۀ لوله مشاهده شد که میزان تشکیل آن به‌صورت بیوفیلم قوی، بیوفیلم متوسط و بیوفیلم منفی گزارش شد (10).

روش کنگورد آگار پلیت
محیط کنگورد آگار با مخلوط‌کردن 37 گرم BHI agar، 50 گرم ساکارز، 0/8 گرم کنگورد و 10 گرم آگار در 1 لیتر آب‌مقطر تهیه شد. سپس محلول فوق با شرایط 121 درجۀ سلسیوس، 15 پوند به‌مدت 15 دقیقه اتوکلاو گشت. برای انجام این آزمون از کشت 24ساعته باکتری در محیط کنگورد کشت داده و به‌مدت 24 ساعت در دمای 35 درجه گرماگذاری شد. بعد از نگهداری پلیت‌ها به‌‌مدت 18 ساعت در دمای اتاق رنگ محیط و کلنی از لحاظ تشکیل بیوفیلم بررسی شد. کلنی‌های قرمز بیوفیلم منفی، کلنی‌های قرمز روی زمینۀ محیط سیاه بیوفیلم + (بیوفیلم ضعیف)، کلنی‌های سیاه روی زمینۀ محیط قرمز بیوفیلم ++ (بیوفیلم متوسط) و کلنی‌های سیاه روی زمینۀ محیط سیاه بیوفیلم +++ (بیوفیلم قوی) ارزیابی شدند (11).

روش میکروتیتر پلیت
برای بررسی کمّی توانایی تشکیل ایزوله‌ها، این روش به کار رفت (12). به‌طور خلاصه، ابتدا جدایه‌ها در محیط تریپتیکاز سوی براث حاوی 1درصد گلوکز به‌مدت 18 تا 20 ساعت در 37 درجه انکوبه شده و سپس سوسپانسیونی معادل نیم مک‌فارلند تهیه شد. پس از آن به هر چاهک الیزا 100 میکرولیتر از این محیط اضافه کرده و میکروپلیت را در 37 درجه 24 ساعت انکوبه شد. پس از 24 ساعت، چاهک‌ها سه بار PBS شست‌وشو یافتند تا باکتری‌های نچسبیده جدا شوند. در مرحلۀ بعد، سایر باکتری‌های چسبیده به چاهک با μl 250 از اتانول 96درصد به‌مدت 15 دقیقه فیکس شدند. سپس هر چاهک با μl200 کریستال ویوله 02/0درصد رنگ‌ شده و پس از 5 دقیقه رنگ با آب‌مقطر شسته شد. پس از خشک‌شدن پلیت‌ها، آنالیز کمّی بیوفیلم با افزودن μl200 از گلاسیال استیک اسید 33درصد به هر چاهک و خواندن OD آنها در طول موج nm 492 توسط دستگاه الیزا محاسبه می‌شد. برای اطمینان از صحت کار، آزمایش‌های فوق 3 بار در زمان‌های مختلف تکرار شد. در ارزیابی بیوفیلم تشکیل‌شده براساس میزان جذب نوری، نمونه‌های با OD کمتر از 1/0 فاقد بیوفیلم، 2/0-1/0 به‌عنوان بیوفیلم ضعیف، 0/3-0/2 به‌عنوان بیوفیلم متوسط و بیش از 0/3 به‌عنوان بیوفیلم قوی در نظر گرفته شدند (8).
آزمون PCR برای ردیابی ژن‌های icaA و icaD
به‌منظور استخراج مادۀ ژنومی سویه‌های تولیدکنندۀ بیوفیلم از روش جوشاندن استفاده شد (13). برای انجام PCR از پرایمرهای اختصاصی icaA و icaD استفاده شد (جدول 1). واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با حجم نهایی 25 میکرولیتر شامل 0/1 میکروگرم DNA الگو، یک میکرومولار از هر پرایمر فوروارد و ریورس، 0/2 میلی‌مولار dNTP، 2 میلی‌مولار MgCl2، 2/5 میکرولیتر بافر PCR و 1 واحد آنزیم Taq DNA Polymerase انجام گرفت. شرایط دمایی واکنش برای هر دو جفت پرایمر در دستگاه ترمال سایکلر بایورد (Bio-Rad, USA) تحت شرایط دمایی 5 دقیقه واسرشت شدن اولیه در دمای 94 درجۀ سلسیوس و در ادامه 50 چرخه شامل واسرشت‌شدن در دمای 94 درجۀ سلسیوس به‌مدت 1 دقیقه، اتصال در دمای 55 درجۀ سلسیوس به‌مدت 60 ثانیه، طویل شدن در دمای 72 درجۀ سلسیوس به‌مدت 30 ثانیه و درنهایت طویل‌شدن نهایی در دمای 72 درجۀ سلسیوس به‌مدت یک دقیقه انجام گرفت (14).
جدول 1. مشخصات پرایمرهای استفاده‌شده در مطالعه
منبع اندازه قطعه (جفت باز bp) توالی (5ʹ-3ʹ) پرایمر
(14) 188 F: TCT CTT GCA GGA GCA ATC AA
R: TCA GGC ACT AAC ATC CAG CA
icaA
(14) 194 F: ATG GTC AAG CCC AGA CAG AG
R: CGT GTT TTC AAC ATT TAA TGC AA
icaD
 
تعیین حساسیت باکتری به آنتی‌بیوتیک
سویه‌های استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس از نظر مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌های جنتامایسین (g30µ)، کلرامفنیکل (g30µ) و نیتروفورانتوئین (g300µ)، اگزاسیلین (g1µ)، مینوسیکلین (µg30) و پنی‌سیلین G (شرکت مست، انگلستان) طبق استانداردهای CLSI با روش انتشار دیسک بررسی شدند. ابتدا سوسپانسیون باکتری از کشت 24-18ساعته در محیط نوترینت براث (شرکت مرک، آلمان) معادل نیم مک‌فارلند با غلظت نهایی 108×1/5 تهیه شد. سپس با استفاده از یک سواپ استریل بر محیط مولر هینتون آگار (شرکت مرک، آلمان) در سه جهت به‌صورت متراکم کشت داده شد. درنهایت، دیسک‌های آنتی‌بیوتیک با استفاده از پنس‌های استریل برداشته شده و در سطح محیط کشت باکتری قرار داده شد. پلیت‌ها در دمای 37 درجۀ سلسیوس گرماگذاری و پس از 24 ساعت با اندازه‌گیری هالۀ رشدنیافتگی اطراف دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی براساس معیارهای CLSI تفسیر شد.
تجزیه‌وتحلیل داده‌ها
در این تحقیق از آمارهای توصیفی میانگین، انحراف‌معیار و نمودار برای توصیف داده‌ها استفاده شد. همچنین اطلاعات به‌دست‌آمده از نمونه‌ها و نتایج ارزیابی‌ها در نرم‌افزار SPSS-16 وارد و با روش Chi-Square آنالیز و تجزیه‌وتحلیل شد و در تمامی موارد سطح معنی‌دار 0/05P< در نظر گرفته شد. آزمون حساسیت و ویژگی، قدرت پیش‌بینی مثبت و منفی و دقت روش‌های کنگورد آگار و لوله‌ای و PCR با استفاده از رابطه‌های ریاضی به‌دست آمد.

یافته‌ها

مشخصات جدایه‌های بررسی‌شده با توجه به نوع نمونه و جنسیت بیماران در جدول 2 ارائه شده است.
 
 
جدول شماره 2. مشخصات مربوط به سن، جنس و درصد پراکنش نوع نمونه‌ها در بین افراد ناقل و بیمار
اطلاعات بیماران   ناقل(درصد) بیمار(درصد)
جنس مرد 14(35) 25(50)
زن 26(65) 25(50)
نوع نمونه بینی 40(100) 0
ادرار 0 26(56)
خون 0 21(42)
چشم 0 1(2)
 
ارزیابی تشکیل بیوفیلم با روش تست لوله
نتایج حاصل از بررسی کیفی تست لوله در نمونه‌های کلینیکی 36درصد بیوفیلم قوی، 22درصد بیوفیلم متوسط و 42درصد بیوفیلم منفی بود. در نمونه‌های ناقلین 15درصد بیوفیلم قوی، 55درصد بیوفیلم متوسط و 30درصد بیوفیلم منفی بود (شکل 1). تفاوت معنی‌داری بین دو گروه بیمار و ناقل مشاهده نشد.

شکل 1. نتایج بیوفیلم در تست لوله. A) بیوفیلم قوی. B) بیوفیلم متوسط. C) بیوفیلم منفی
ارزیابی تشکیل بیوفیلم با روش کنگورد آگار
نتایج حاصل از بررسی کیفی تشکیل بیوفیلم در روش کنگورد آگار در 90 جدایه استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس به‌دست‌آمده از نمونه‌های بالینی و ناقلین نشان داد که در نمونه‌های کلینیکی، 55درصد بیوفیلم منفی (کلنی‌های قرمز)، 7درصد بیوفیلم ضعیف (کلنی‌های قرمز روی زمینۀ محیط سیاه)، 19درصد بیوفیلم متوسط (کلنی‌های سیاه روی زمینۀ محیط قرمز) و 29درصد بیوفیلم قوی (کلنی‌های سیاه روی زمینۀ سیاه) بودند. در ناقلین 30درصد بیوفیلم منفی، 5/32درصد بیوفیلم ضعیف، 10درصد بیوفیلم متوسط و 5/27درصد بیوفیلم قوی را تشکیل دادند (شکل 2). تفاوت معنی‌داری در نتایج حاصله بین دو گروه بیمار و ناقل مشاهده نشد.
 

شکل 2. نتایج بیوفیلم در محیط کشت کنگورد آگار. A) بیوفیلم منفی (کلنی‌های قرمز بر روی محیط قرمز)، B) بیوفیلم ضعیف (کلنی‌های قرمز روی زمینۀ محیط سیاه)، C) بیوفیلم متوسط (کلنی‌های سیاه روی زمینۀ محیط قرمز) و D) بیوفیلم قوی (کلنی‌های سیاه روی زمینۀ سیاه).
ارزیابی تشکیل بیوفیلم با روش میکروتیتر پلیت
نتایج حاصل از بررسی کمّی تشکیل بیوفیلم در جدایه‌های بالینی 36درصد فاقد توانایی تشکیل بیوفیلم، 7درصد بیوفیلم ضعیف، 23درصد بیوفیلم متوسط و 34درصد بیوفیلم قوی را نشان دادند. در نمونه‌های ناقلین 5/27درصد بیوفیلم منفی، 5/9درصد بیوفیلم ضعیف، 5/62درصد بیوفیلم متوسط و 5درصد بیوفیلم قوی را تشکیل دادند (شکل 3).

شکل 3. تشکیل بیوفیلم در روش میکروتیتر پلیت
نتایج آزمون PCR برای ژن‌های icaA و icaD
آزمون PCR برای ژن icaA (bp 188) در تمام نمونه‌های کلینیکی و ناقلین که با روش میکروتیتر پلیت توانایی تشکیل بیوفیلم داشتند مثبت بود. icaD (bp 198) در 25 جدایه از ناقلین (2/86درصد) و 27 جدایه از نمونه‌های کلینیکی (37/84درصد) مثبت بود (شکل 4). درمجموع PCR با استفاده از ژن icaA با روش فنوتیپی میکروتیتر پلیت همخوانی داشت و ژن icaD برای 10 جدایه که با روش میکروتیتر پلیت به‌عنوان تشکیل‌دهندۀ بیوفیلم شناسایی شدند، منفی بود و یک جدایه از نمونه‌های ادرار با روش PCR icaD مثبت، اما با روش میکروتیتر پلیت منفی گزارش شد.


شکل 4. شناسایی ژن‌های icaA (A) و icaD (B) در نمونه‌های استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس. M: bp 100DNA مارکر؛ N: کنترل منفی؛ P: کنترل مثبت؛ ستون 5-1: محصولات PCR برای ژن‌های اختصاصی.
مقایسۀ نتایج تشکیل بیوفیلم در روش‌های فنوتیپی و مولکولی
از بین 90 نمونه، 61 جدایه توانایی تشکیل بیوفیلم داشتند که 58 جدایه با روش کنگورد آگار و 57 جدایه با روش لوله‌ای شناسایی شدند. روش MTP به‌عنوان استاندارد طلایی برای ارزیابی دو روش کیفی TM و CRA استفاده شد (جدول 3) (9، 15، 16). حساسیت، ویژگی، قدرت پیش‌بینی مثبت، قدرت پیش‌بینی منفی و دقت آزمون‌ها با استفاده از اطلاعات جدول 4 طبق فرمول محاسبه شد. حساسیت روش لوله‌ای (93درصد) از حساسیت روش کنگورد (55/73درصد) بالاتر بود. حساسیت در روش PCR با استفاده از ژن icaA از دو روش فنوتیپی CRA و TM بالاتر (100درصد)، اما با استفاده از ژن icaD از دو روش فنوتیپی مذکور کمتر به‌دست آمد (83/6). دقت در روش PCR icaA در مقایسه با سایر روش‌ها بیشتر بود (جدول 5).
جدول 3. مقایسۀ نتایج تشکیل بیوفیلم‌ها در روش‌های فنوتیپی و مولکولی
مشخصات (تعداد) تعداد تشکیل بیوفیلم (درصد) حضور ژن در سویه‌های تشکیل‌دهندۀ بیوفیلم (درصد)
میکروتیتر پلیت کنگورد آگار لوله‌ای
ناقل (40) بینی (40) منفی مثبت منفی مثبت منفی مثبت icaA icaD
11
(5/27)
29
(5/72)
25
(5/62)
15
(5/37)
12
(30)
28
(70)
29
(100)
25
(2/86)
بیمار (50) ادرار (28) 13
(42/46)
15
(58/53)
17
(72/60)
11
(28/39)
14
(50)
14
(50)
15
(100)
16
(100)
خون (21) 5
(8/23)
16
 (2/76)
13
(42/46)
8 (57/28) 6
(57/28)
15 (43/71) 16
 (100)
10
(5/62)
چشم (1) 0 1
(100)
1
(100)
0
 
1
(100)
0 1
(100)
1
(100)
مجموع (90) 90 29 (22/32) 61
(79/67)
56
(22/62)
34 (78/37) 33
(66/36)
57 (34/63) 61
 (100)
52
(24/85)
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 


 
جدول 4. تشکیل بیوفیلم با استفاده از روش‌های TM، CRA، TCP و PCR
روش آزمایش کنگورد آکار لوله‌ای PCR icaA PCR icaD
مثبت منفی مثبت منفی مثبت منفی مثبت منفی
میکروتیتر پلیت مثبت 34 27 57 4 61 0 51 10
منفی 0 29 0 29 0 29 1 28
 
 
جدول 5. آنالیز آماری روش‌های کنگورد آگار و لوله‌ای در مقایسه با روش استاندارد طلایی میکروتیتر پلیت برای تشخیص تشکیل بیوفیلم  در استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس
روش‌های تشخیص بیوفیلم حساسیت* (درصد) ویژگی** (درصد) قدرت پیش‌بینی مثبت*** (درصد) قدرت پیش‌بینی منفی**** (درصد) دقت***** (درصد)
کنگورد اگار 73/55 100 100 78/51 70
لوله‌ای 93 100 100 87 95
PCR icaA 100 100 100 100 100
PCR icaD 6/83 55/96 07/98 68/73 77/87
* Sensitivity, **Specificity, ***Positive Predictive Power, ****Negative Predictive Power, *****Accuracy
 
مقاومت جدایه‌های استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس به آنتی‌بیوتیک‌های موردمطالعه
مقایسۀ درصد فراوانی سویه‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک‌های مختلف در 90 جدایه استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس نشان داد که میزان مقاومت آنتی‌بیوتیکی در سویه‌های کلینیکی از سویه‌های افراد ناقل سالم بیشتر بوده است (نمودار 1).
میزان تولید بیوفیلم در روش میکروتیتر پلیت براساس مقاومت دارویی
نتایج حاصل از بررسی کمّی تشکیل بیوفیلم در روش میکروتیتر پلیت در 90 جدایۀ استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس براساس مقاومت آنتی‌بیوتیکی در نمودار 2 نشان داده شده است. توانایی تشکیل بیوفیلم در جدایه‌های مقاوم به‌طور معنی‌داری بیش از جدایه‌های حساس بود ( 0/0001 > P)
 
نمودار 1. درصد فراوانی سویه‌های استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس مقاوم به آنتی‌بیوتیک در سویه‌های کلینیکی و سویه‌های جداشده از افراد سالم



 
نمودار 2. مقایسۀ مقاومت و حساسیت دارویی با میزان تولید بیوفیلم براساس روش میکروتیتر پلیت
 
 بحث و نتیجه‌گیری
یکی از مهم‌ترین فاکتورهای که استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس را به یک پاتوژن مهم بیمارستانی تبدیل کرده است، توانایی این باکتری در اتصال به سطوح به مواد و تجهیزات بیمارستانی و متعاقب آن، ایجاد بیوفیلم است. شناسایی سویه‌های ایجادکنندۀ بیوفیلم استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس با استفاده از روشی مناسب و شناخت مکانیسم‌های اتصالی آنها در تولید بیوفیلم می‌تواند به فهم درست استفاده از تجهیزات پزشکی مصنوعی و جلوگیری از افزایش مقاومت به داروها کمک کند. تاکنون روش‌های مختلفی فنوتیپی و مولکولی برای تشخیص بیوفیلم توسط باکتری‌ها استفاده شده که در بین این روش‌ها، MTP به‌عنوان روش استاندارد طلایی معرفی شده است (17). در این مطالعه، توانایی تشکیل بیوفیلم با استفاده از روش‌های فنوتیپی TM، CRA، MTP و روش مولکولی PCR با استفاده از ژن‌های icaA و icaD در نمونه‌های بالینی و ناقلین بررسی شد. آزمون CRA به‌عنوان یک روش کیفی در شناسایی بیوفیلم توانست 78/38درصد از جدایه‌های تولیدکنندۀ بیوفیلم (34 از 90 سویه) را شناسایی کند که مشابه یافته‌های حاصل از مطالعات Arslan  و همکاران (18) و Satorres و همکاران (19) بود که به‌ترتیب 5/38 و 3/41 درصد از سویه‌های تشکیل‌دهندۀ بیوفیلم را شناسایی کردند. در مقابل این مقادیر، گزارش‌هایی از پایین‌بودن توانایی CRA در ارزیابی باکتری‌های تولیدکنندۀ بیوفیلم از سوی Kord و همکاران در ایران (20) و Mathur در هند به‌دست آمده است که این روش را برای شناسایی بیوفیلم توصیه نکرده‌اند (9). اختلاف در نتایج گزارش‌های اعلام‌شده می‌تواند به‌علت اختلاف در منشأ نمونه، ترکیبات و شرایط گرماگذاری متفاوت محیط CRA و تفاسیر مختلف از رنگ کلنی و محیط باشد. روش MTP علاوه بر اینکه توانایی تشکیل بیوفیلم جدایه‌ها را تشخیص می‌دهد می‌تواند میزان تشکیل بیوفیلم را به‌صورت کمّی اندازه‌گیری کند. با استفاده از این روش، در مطالعۀ حاضر 61 جدایه (67/79درصد) بیوفیلم تشکیل دادند و 29 جدایه (22/32درصد) از نظر تشکیل بیوفیلم منفی بودند. نتایج حاصل از بررسی کمّی تشکیل بیوفیلم در جدایه‌های بالینی 36درصد فاقد توانایی تشکیل بیوفیلم، 7درصد بیوفیلم ضعیف، 23درصد بیوفیلم متوسط و 34درصد بیوفیلم قوی را نشان دادند. در نمونه‌های ناقلین 27/5درصد بیوفیلم منفی، 5/9درصد بیوفیلم ضعیف، 5/62درصد بیوفیلم متوسط و 5درصد بیوفیلم قوی را تشکیل دادند که مشابه یافته‌های مطالعه NTA El-Khier و همکاران بود. در این مطالعه 30/8درصد از سویه‌ها توانایی تشکیل بیوفیلم قوی، 12/8درصد بیوفیلم متوسط، 7/7درصد بیوفیلم ضعیف داشتند (21). سومین روش فنوتیپی که برای بررسی بیوفیلم ناشی از استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس در این مطالعه استفاده شد، روش لوله‌ای بود. این روش توانست بیوفیلم را در 57 جدایه (63/34) تشخیص دهد که در نمونه‌های کلینیکی 36درصد بیوفیلم قوی، 22درصد بیوفیلم متوسط و 42درصد بیوفیلم منفی بود. در نمونه‌های ناقلین 15درصد بیوفیلم قوی، 55درصد بیوفیلم متوسط و 30درصد بیوفیلم منفی بود. طبق نتایج مطالعۀ ما و در مقایسه با نتایج حاصل از روش CRA نشان داد که این روش قابلیت شناسایی بهتری دارد که موافق با نتایج حاصل از مطالعۀRuzicka  و همکاران بود (22). اما این روش در مقایسه با MTP برای بررسی تولید بیوفیلم، به‌دلیل تفاسیر مختلف از آزمایش‌ها توسط مشاهدات افراد اختلاف و تشخیص بین انواع مختلف متوسط، ضعیف و منفی، دشوار است. براساس نتایج به‌دست‌آمده از مطالعۀ ما و مطالعات گذشته، روش TM نمی‌تواند روشی مناسب برای غربال‌گری سویه‌های تولیدکنندۀ بیوفیلم باشد (10).
در این مطالعه، برای بررسی بیوفیلم از روش مولکولی PCR با استفاده از ژن‌های icaA و icaD استفاده شد. مشابه مطالعۀ Gad و همکاران (23)، ژن icaA توانست تمامی جدایه‌های تشکیل‌دهندۀ بیوفیلم را شناسایی کند (100درصد). ژن icaD در 52 از 61 سویۀ تولیدکنندۀ بیوفیلم (85/24درصد) شناسایی شد که نتایج حاصله مطابق با مطالعۀ Kord و همکاران بود (20). در مطالعۀ حاضر، یکی از سویه‌های icaD مثبت توانایی تشکیل بیوفیلم را در روش‌های فنوتیپی نداشت که این نشان‌دهندۀ آن است که تولید بیوفیلم همیشه وابسته به این ژن‌ها نیست. به‌طور مشابهی در مطالعۀOliveira  و همکاران یکی از سویه‌های استافیلوکوکوک کواگولاز منفی که در روش MTP تولیدکنندۀ قوی بیوفیلم بود، حامل هیچ‌کدام از ژن‌های ica نبود (24). مطالعات مختلفی گزارش کرده‌اند که حضور برخی ژن‌های خاص مانند aap و bhp در بعضی از سویه‌های استافیلوکوکوک بیوفیلم منفی در بروز این پدیده نقش دارد (25، 26). در مطالعۀ حاضر، سویه‌هایی وجود داشتند که با وجود مثبت‌بودن ژن‌های icaA و icaD توانایی تشکیل بیوفیلم را در روش‌های فنوتیپی نداشتند. یک دلیل برای تشکیل‌نشدن بیوفیلم در این سویه‌ها می‌تواند نداشتن icaC باشد. طبق بررسی‌های انجام‌شده تغییرات فنوتیپی می‌تواند به‌علت جهش‌های حذفی یا اضافی در اپرون ica باشد که باعث غیرفعال‌شدن ژن‌های ica می‌شود (21). طبق یافته‌های Ziebuhr و همکاران وارد‌شدن IS256 در اپرون ica باعث غیرفعال‌سازی ژن icaA و فقدان تشکیل بیوفیلم در روش‌های فنوتیپی است (27). مقایسۀ بین روش‌های فنوتیپی و روش‌های مولکولی با استفاده از ژن‌های icaA و icaD برای تشخیص بیوفیلم در مطالعۀ ما نشان داد که MTP بهترین روش برای تشخیص بیوفیلم با بیشترین حساسیت و اختصاصیت است و استفادۀ هم‌زمان آن با روش‌های مولکولی توصیه می‌شود.
از بین 90 جدایۀ استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس، 29 جدایه از ناقلین (32/22درصد) و 32 جدایه (33/55درصد) از نمونه‌های کلینیکی توانایی تشکیل بیوفیلم را داشتند که با مطالعات گذشته مطابقت دارد. از بین 50 نمونۀ بالینی با منشأ چشم، خون و ادرار، نمونه‌های کشت خون با درصد (2/76) دارای بیشترین توانایی در تشکیل بیوفیلم بود. در بررسی‌های Kozitskaya و همکاران در آلمان روی استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس، مشخص شد که از بین نمونه‌های بالینی مورد مطالعه، سویه‌های جداشده از کشت خون با بالاترین درصد (87درصد) بیشترین توانایی در تولید بیوفیلم را داشتند که از این نظر با مطالعۀ ما مطابقت داشت (28). در مطالعۀ حاضر، مقاومت آنتی‌بیوتیکی سویه‌ها با استفاده از روش دیسک دیفیوژن بررسی شد، میزان مقاومت دارویی در سویه‌های بالینی از سویه‌های ناقلین بیشتر بود که از این نظر با مطالعۀ  Kozitskaya و همکاران مطابقت دارد (28). همچنین بررسی تولید بیوفیلم براساس مقاومت دارویی نشان داد که سویه‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک توانایی بیشتری در تولید بیوفیلم دارند.
مطالعۀ حاضر با مقایسه بین روش‌های فنوتیپی و روش‌های مولکولی با استفاده از ژن‌های icaA و icaD برای تشخیص بیوفیلم نشان داد که MTP روش مناسبی برای تشخیص بیوفیلم با بیشترین حساسیت و اختصاصیت است و استفادۀ هم‌زمان آن با روش‌های مولکولی توصیه می‌شود.

سپاسگزاری

نویسندگان این مقاله از همکاری دانشگاه آزاد اسلامی، دانشگاه علوم پزشکی، آزمایشگاه‌ها و بیمارستان‌های آموزشی ـ درمانی شهرستان گرگان کمال تشکر و قدردانی را دارند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.
 
نوع مطالعه: پژوهشي | موضوع مقاله: باکتری شناسی پزشکی
دریافت: 1397/9/14 | پذیرش: 1397/11/10 | انتشار الکترونیک: 1398/1/9

فهرست منابع
1. Otto M. Staphylococcus epidermidis—the'accidental'pathogen. Nat Rev Microbiol. 2009; 7(8): 555. [DOI:10.1038/nrmicro2182]
2. Mack D, Becker P, Chatterjee I, Dobinsky S, Knobloch JK, Peters G, Rohde H, Herrmann M. Mechanisms of biofilm formation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus: functional molecules, regulatory circuits, and adaptive responses. Int J Med Microbiol. 2004; 294(2-3): 203-12. [DOI:10.1016/j.ijmm.2004.06.015]
3. Ciofu O, Mandsberg LF, Wang H, Høiby N. Phenotypes selected during chronic lung infection in cystic fibrosis patients: implications for the treatment of Pseudomonas aeruginosa biofilm infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 2012; 65(2): 215-25. [DOI:10.1111/j.1574-695X.2012.00983.x]
4. Høiby N, Bjarnsholt T, Givskov M, Molin S, Ciofu O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int J Antimicrob Agents. 2010; 35(4): 322-32. [DOI:10.1016/j.ijantimicag.2009.12.011]
5. Bazzaz BS, Khameneh B, Zarei H, Golmohammadzadeh S. Antibacterial efficacy of rifampin loaded solid lipid nanoparticles against Staphylococcus epidermidis biofilm. Microbial pathogenesis. 2016; 93: 137-44. [DOI:10.1016/j.micpath.2015.11.031]
6. Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 1999; 284(5418): 1318-22. [DOI:10.1126/science.284.5418.1318]
7. De Silva GD, Kantzanou M, Justice A, Massey RC, Wilkinson AR, Day NP, Peacock SJ. The ica operon and biofilm production in coagulase-negative staphylococci associated with carriage and disease in a neonatal intensive care unit. Journal of clinical microbiology. 2002; 40(2): 382-8. [DOI:10.1128/JCM.40.02.382-388.2002]
8. Christensen GD, Simpson WA, Younger JJ, Baddour LM, Barrett FF, Melton DM, Beachey EH. Adherence of coagulase-negative staphylococci to plastic tissue culture plates: a quantitative model for the adherence of staphylococci to medical devices. Journal of clinical microbiology. 1985; 22(6): 996-1006.
9. Mathur T, Singhal S, Khan S, Upadhyay DJ, Fatma T, Rattan A. Detection of biofilm formation among the clinical isolates of staphylococci: an evaluation of three different screening methods. Indian J Med Microbiol. 2006; 24(1): 25. [DOI:10.4103/0255-0857.19890]
10. Christensen GD, Simpson WA, Bisno AL, Beachey EH. Adherence of slime-producing strains of Staphylococcus epidermidis to smooth surfaces. Infection and immunity. 1982; 37(1): 318-26.
11. Freeman DJ, Falkiner FR, Keane CT. New method for detecting slime production by coagulase negative staphylococci. J Clin Pathol. 1989; 42(8): 872-4. [DOI:10.1136/jcp.42.8.872]
12. Mortazavi H, Nakhaei Moghaddam M, Abadi NS. Study of the Effect of Silver Nanoparticles on Biofilms Formation by Staphylococcus epidermidis. Journal of Rafsanjan University of Medical Sciences. 2015; 14(2): 125-36.
13. Rahimi F, Bouzari M, Maleki Z, Rahimi F. Antibiotic susceptibility pattern among Staphylococcus spp. with emphasis on detection of mecA gene in methicillin resistant Staphylococcus aureus isolates. Iranian Journal of Clinical Infectious Diseases. 2009; 4(3).
14. Arciola CR, Baldassarri L, Montanaro L. Presence of icaA and icaDGenes and slime production in a collection of Staphylococcal strains from catheter-associated infections. Journal of clinical microbiology. 2001; 39(6): 2151-6. [DOI:10.1128/JCM.39.6.2151-2156.2001]
15. Panda PS, Chaudhary U, Dube SK. Comparison of four different methods for detection of biofilm formation by uropathogens. Indian J Pathol Microbiol. 2016; 59(2): 177. [DOI:10.4103/0377-4929.182013]
16. Hassan A, Usman J, Kaleem F, Omair M, Khalid A, Iqbal M. Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates. Braz J Infect Dis. 2011; 15(4): 305-11. [DOI:10.1016/S1413-8670(11)70197-0]
17. Deka N. Comparison of Tissue Culture plate method, Tube Method and Congo Red Agar Method for the detection of biofilm formation by Coagulase Negative Staphylococcus isolated from Non-clinical Isolates. Int J Curr Microbiol App Sci. 2014; 3(10): 810-5.
18. Arslan S, Özkardes F. Slime production and antibiotic susceptibility in staphylococci isolated from clinical samples. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 2007; 102(1): 29-33.
19. Satorres SE, Alcaráz LE. Prevalence of icaA and icaD genes in Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis strains isolated from patients and hospital staff. Cent Eur J Public Health. 2007; 15(2): 87-90.
20. Kord M, Ardebili A, Jamalan M, Jahanbakhsh R, Behnampour N, Ghaemi EA. Evaluation of Biofilm Formation and Presence of Ica Genes in Staphylococcus epidermidis Clinical Isolates. Osong Public Health Res Perspect. 2018; 9(4): 160. [DOI:10.24171/j.phrp.2018.9.4.04]
21. El-Khier NTA, El-Kazzaz SS, Elganainy AE. Phenotypic and Genotypic Detection of Biofilm Formation in Staphylococcus epidermidis Isolates from Retrieved Orthopaedic Implants and Prostheses. Br Microbiol Res J. 2015; 9(4): 1-10. [DOI:10.9734/BMRJ/2015/18650]
22. Růžička F, Hola V, Votava M, Tejkalova R, Horvát R, Heroldová M, Woznicová V. Biofilm detection and the clinical significance ofStaphylococcus epidermidis isolates. Folia Microbiol. 2004; 49(5): 596.
23. Gad GF, El-Feky MA, El-Rehewy MS, Hassan MA, Abolella H, El-Baky RM. Detection of icaA, icaD genes and biofilm production by Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis isolated from urinary tract catheterized patients. J Infect Dev Ctries. 2009; 3(05): 342-51.
24. Oliveira A, Maria de Lourdes RS. Comparison of methods for the detection of biofilm production in coagulase-negative staphylococci. BMC Res Notes. 2010; 3(1): 260. [DOI:10.1186/1756-0500-3-260]
25. Rohde H, Burdelski C, Bartscht K, Hussain M, Buck F, Horstkotte MA, Knobloch JK, Heilmann C, Herrmann M, Mack D. Induction of Staphylococcus epidermidis biofilm formation via proteolytic processing of the accumulation‐associated protein by staphylococcal and host proteases. Molecular microbiology. 2005; 55(6): 1883-95.
26. Tormo MA, Knecht E, Götz F, Lasa I, Penades JR. Bap-dependent biofilm formation by pathogenic species of Staphylococcus: evidence of horizontal gene transfer?. Microbiology. 2005; 151(7): 2465-75. [DOI:10.1099/mic.0.27865-0]
27. Ziebuhr W, Krimmer V, Rachid S, Lößner I, Götz F, Hacker J. A novel mechanism of phase variation of virulence in Staphylococcus epidermidis: evidence for control of the polysaccharide intercellular adhesin synthesis by alternating insertion and excision of the insertion sequence element IS256. Molecular microbiology. 1999; 32(2): 345-56. [DOI:10.1046/j.1365-2958.1999.01353.x]
28. Kozitskaya S, Cho SH, Dietrich K, Marre R, Naber K, Ziebuhr W. The bacterial insertion sequence element IS256 occurs preferentially in nosocomial Staphylococcus epidermidis isolates: association with biofilm formation and resistance to aminoglycosides. Infection and immunity. 2004; 72(2): 1210-5. [DOI:10.1128/IAI.72.2.1210-1215.2004]

ارسال نظر درباره این مقاله : نام کاربری یا پست الکترونیک شما:
CAPTCHA

ارسال پیام به نویسنده مسئول


کلیه حقوق این وب سایت متعلق به مجله میکروب شناسی پزشکی ایران می باشد.

طراحی و برنامه نویسی : یکتاوب افزار شرق   ناشر: موسسه فرنام

© 2020 All Rights Reserved | Iranian Journal of Medical Microbiology

Designed & Developed by : Yektaweb Publishr: Farname Inc.