سال 13، شماره 1 - ( فروردین - اردیهبشت 1398 )
جلد 13 شماره 1 صفحات 43-32 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Maleki A, Fahimi H, Taghizadeh M. Determining Difference in Evolutionary Variation of Bacterial RecA proteins vs 16SrRNA Genes by using 16s_Toxonomy Tree. Iran J Med Microbiol 2019; 13 (1) :32-43
URL: http://ijmm.ir/article-1-886-fa.html
URL: http://ijmm.ir/article-1-886-fa.html
ملکی آویسا، فهیمی حسین، تقی زاده محمد. تعیین تفاوت تغییرات در طول تکامل برای پروتئین‌های باکتریایی RecA در مقایسه با ژن 16SrRNA با استفاده از درخت 16S-تاکسونومی. مجله میکروب شناسی پزشکی ایران. 1398; 13 (1) :32-43
آویسا ملکی1 
، حسین فهیمی1 ، محمد تقی زاده 
2
، حسین فهیمی1 ، محمد تقی زاده 2
1- گروه ژنتیک، دانشکده علوم و فناوری‌های نوین، واحد علوم پزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
2- گروه بیوتکنولوژی میکروبی، دانشکده علوم و فناوری‌های نوین، واحد علوم پزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران ،mtaghizadeh@Alumni.ut.ac.ir
2- گروه بیوتکنولوژی میکروبی، دانشکده علوم و فناوری‌های نوین، واحد علوم پزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران ،
واژه‌های کلیدی: درخت تاکسونومی، خانواده پروتئینی RecA باکتریایی، ژن 16SrRNA، درخت 16S-تاکسونومی، مقاومت دارویی
متن کامل [PDF 1791 kb]
(2761 دریافت)
| چکیده (HTML) (8366 مشاهده)
همان‌طور که در بخش روش کار قسمت انتخاب توالی توضیح داده شد، با استفاده از پایگاه داده پروسایت توالی‌های خانواده پروتئینی RecA استخراج شدند و پس از دسته‌بندی از میان 104 کلاستر حاصل‌شده، 30 گونه به عنوان جنس و گونه‌های نماینده انتخاب شدند. هدف اصلی این پژوهش تعیین میزان تغییرات در پروتئین‌های RecA در طول زمان تکاملی آنها در مقایسه با حفظ‌شده‌ترین ژن شناخته‌شده بود که به صورت کلاسیک ژن 16SrRNA معرفی می‌شود. بر پایه این هدف می‌توان به گونه‌هایی که سرعت تغییرات پروتئین RecA آنها بیشترین و کمترین مقدار بوده است، دست پیدا کرد. به این ترتیب می‌توان تعیین کرد سرعت تغییرات برای ژن مربوط به پروتئین RecA باکتریایی در کدام گونه بسیار زیاد و در کدام گونه بسیار کم است. این مسئله می‌تواند نوعی پیشگویی برای یکی از دلایل ایجاد مقاومت باکتری‌ها به دارو‌ها طی زمان طولانی باشد. به طور اساسی تعیین میزان تغییرات در پروتئین RecA باکتریایی در گونه‌های مختلف به طور مستقل اطلاعات پایه‌ای مهمی را در اختیار ما قرار می‌دهد.
درخت تاکسونومی حاصل برای 30 گونه انتخابی
برای به‌دست‌آوردن رابطه تکاملی میان گونه‌های انتخابی، در قدم اول درخت تاکسونومی از Taxonomy browser پایگاه داده NCBI استخراج شد. شکل 1 درخت تاکسونومی مربوط به 30 گونه انتخابی را نشان می‌دهد. در این درخت 8 شاخه اصلی دیده می‌شود که هر کدام از آنها مربوط به یک فایلوم باکتریایی مجزاست. سؤال مهمی که اینجا مطرح است این است که ترتیب شاخه‌های اصلی باید چگونه باشد؛ یعنی کدام شاخه قدیمی‌تر است و کدام شاخه‌‌ها باید پس از آن قرار داده شوند؟
برای اصلاح ترتیب شاخه‌های اصلی درخت تاکسونومی، باید یک قاعده مناسب تعیین شود. به این منظور از توالی کامل 16SrRNA مربوط به 30 گونه انتخابی استفاده شد. برای پیداکردن و استفاده از یک قاعده مناسب مراحل زیر به ترتیب انجام شد:
1. کسب اطمینان از صحیح‌بودن جایگاه تکاملی شاخه‌های فرعی درون هر شاخه اصلی اطمینان حاصل شد.
به این منظور دو بررسی صورت گرفت. در اولین بررسی، رده‌بندی‌های تاکسونومی 30 گونه انتخابی با استفاده از مرورگر تاکسونومی ان سی بی ای (NCBI Taxonomy Browser) استخراج و به تفکیک شاخه‌های اصلی، دسته‌بندی شدند. نتیجه این بررسی در شکل 2 قابل مشاهده است. همان‌طور که در شکل 2 دیده می‌شود، گونه‌های موجود در هر شاخه اصلی، حداقل از بخش فایلوم با یکدیگر مشابه هستند. البته در بعضی از شاخه‌های اصلی میزان این شباهت تا رده‌های پایین‌تر ادامه پیدا می‌کند.
همان‌طور که در شکل 6 قابل ملاحظه است، فایلوم Actinobacteria در درخت 16S-تاکسونومی نزدیک‌ترین فایلوم به فایلوم سرگروه است، اما در درخت RecA دورترین فایلوم است. این مسئله نشان می‌دهد ژن RecA در فایلوم Actinobacteria در مقایسه با ژن 16SrRNA تغییرات بسیار بیشتری در طول تکامل خود داشته است. در حالی که در باقی فایلوم‌هایی که در شکل دیده می‌شوند، میزان تغییرات در طول دوره تکاملی با فایلوم آکتینوباکتریوم متفاوت است. بنابراین می‌توان گفت که تغییرات RecA در فایلوم‌های مختلف سرعت‌های متنوعی داشته است و این سرعت‌های متنوع در بیشتر موارد به طور کلی تفاوت‌های اساسی با الگوی تغییرات در ژن‌های 16SrRNA نظیر دارد. فایلوم بعدی که دستخوش بیشترین تغییرات شده است، فایلوم Proteobacteria است. فایلوم سیانوباکتر Cyanobacteria در هر دو درخت جایگاه ثابت دارد. فایلوم‌های Deniococcus و Tenericutes هر دو به اندازه یک فایلوم در درخت RecA نسبت به درخت16S -تاکسونومی از سرگروه فاصله گرفتند.
مقایسه نتایج فیلوژنتیک برای جانداران خاص با استفاده از ژن‌های مختلف می‌تواند تعیین کند کدام ژن‌ها برای مطالعات تکاملی مفید هستند؛ همچنین اینکه آیا تاریخچه ژن‌های متنوع با یکدیگر متفاوت است. با این حال، برای مقایسه‌های مستقیم مهم است که متغیرهای زیادی را در مطالعات ژن‌های مختلف حذف کنیم (20). بسیاری از محققان برای مطالعه سیستماتیک باکتریایی، درخت فیلوژنتیک یک ژن خاص را با درخت استاندارد یک ژن rRNA مقایسه می‌کنند (21). در دهه گذشته، توالی‌های ژن 16SrRNA برای مشخص‌کردن تفاوت‌های درون و بین گونه‌ای در بعضی از خانواده‌های باکتریایی کاربرد داشت (22). در سال‌های اخیر به منظور دسته‌بندی جدید گونه‌های مایکوباکتریوم از شباهت توالی‌های نوکلوتیدی 16SrRNA استفاده کردند. برای این منظور توالی‌های 16SrRNA از گونه‌های مختلف مایکوباکتریوم را همترازسازی کردند که نتیجه حاصل نشان‌دهنده میزان شباهت 85 الی 95 درصدی بین توالیها بود. به همین علت برای تفسیر دقیق‌تر به بررسی توالیها در سطح درون‌گونه‌ای و بین‌گونه‌ای پرداختند. پس از انجام همترازسازی دوگانه توالی‌های 16SrRNA در سطح بین‌گونه‌ای، متوجه شباهت 95 الی 98 درصدی در خانواده مایکوباکتریوم شدند. همچنین میزان شباهت برای توالی‌های 16SrRNA درون‌گونه‌ای 98 درصد به بالا بود (11).
در این پژوهش نیز ما به بررسی روند تکاملی خانواده پروتئینی RecA در مقایسه با توالی‌های 16SrRNA نظیر پرداختیم. پس از استخراج درخت 16SrRNA از پایگاه داده NCBI بررسی توالیها در سطح درون‌فایلومی و بین‌فایلومی صورت گرفت. نتیجه‌ای که از همترازسازی دوگانه حاصل شد این است که توالی‌های 16SrRNA درون یک فایلوم شباهت‌های بسیاری با یکدیگر دارند و این شباهت بین 77 تا 98 درصد است. همچنین با مقایسه صورت‌گرفته (همترازسازی دوگانه) بین نماینده‌های انتخابی هر فایلوم با فایلوم‌های دیگر شاهد کاهش میزان شباهت بین فایلومی هستیم (میزان شباهت بین 69 تا 81 درصد است).
در دیگر مطالعات انجام شده برای بررسی توالی‌های 16SrRNA در مقایسه با ژن RecA، تمام توالی‌های موجود حتی توالی‌های ناقص استخراج‌شده از پایگاه داده را بررسی کردند (23)، اما در پژوهش ما از توالی‌های کامل و گونه‌های یکسان از16SrRNA و خانواده پروتئینی RecA استفاده شد تا نتایج کامل‌تری ارائه شود. همچنین در تحقیقات دیگر از الگوریتم‌های شناخته‌شده برای ترسیم درخت فیلوژنی استفاده شده است، ولی در این پژوهش برای رسم درخت تکاملی با انجام بیش از 200 همترازسازی برای 30 توالی و همچنین با کمک درخت خام تاکسونومی استخراج‌شده از NCBI، توانسته‌ایم روشی جدید را برای رسم درخت فیلوژنی برای تعداد توالی‌های محدود ارائه کنیم (24).
بعد از بررسی‌های لازم و اهمیت جایگاه فایلوم‌ها در این پژوهش، درخت تاکسونومی از پایگاه داده NCBI بخش تاکسونومی، استخراج شد و با همترازسازی‌هایی که در قسمت‌های قبل توضیح داده شد، جایگاه فایلوم‌ها مشخص شد. سپس به مقایسه و بررسی جایگاه فایلوم‌ها در درخت RecA تاکسونومی پرداخته شد و با درخت رفرنس 16S-تاکسونومی مقایسه شد. تفاوت عمده این پژوهش با کار‌های مشابه در نحوه استخراج درخت فیلوژنی و بررسی روند تکاملی خانواده پروتئینی RecA در مقایسه با ژن ریبوزومی بود که بعضی از فایلوم‌ها طی روند تکاملی تغییرات بسیار زیادی را داشتند.
جایگاه فایلوم سیانوباکتریا در درخت 16S-تاکسونومی و RecA ثابت است که نشان‌دهنده ثبات ژنی و کمترین جهش طی تکامل است. همچنین بیشترین تغییر مربوط به فایلوم آکتینوباکتریا است. تعیین بیشترین و کمترین میزان تغییرات گونه‌های استفاده‌شده در این پژوهش طی روند تکاملی برای بررسی مقاومت‌های دارویی نیز حائز اهمیت است. به این صورت که هر چقدر نرخ تغییرات طی تکامل برای گونه‌ای بیشتر باشد، دارو‌های موجود برای از بین بردن این گونه باکتریایی ممکن است طی مدت طولانی کارآمد نباشد.
با توجه به اهمیت روند تکاملی و تغییرات باکتری‌ها و ژن‌های آنها که باعث ایجاد مقاومت دارویی می‌شوند، در این پژوهش برای بررسی تغییرات فایلوم‌های باکتریایی پروتئین RecA در مقایسه با ژن حفظشده 16SrRNA، درخت تاکسومی نوینی برای جنس و گونه‌های منتخب ژن 16SrRNA و خانواده پروتئینی RecA ارائه شده است که با الگوریتم‌های موجود بیوانفورماتیکی متفاوت است. درنهایت می‌توان شاهد تغییرات چشمگیر فایلوم Actinobacteria بود. جنس و گونه‌هایی که در این فایلوم قرار دارند اهمیت زیادی برای بررسی مقاومت دارویی باکتریایی به دلیل تغییرات و جهش‌های عمده دارند. یکی از جنس‌ها و گونه‌های شناخته‌شده در این فایلوم Mycobacterium Tuberculosis است. از جهتی دیگر می‌توان به فایلوم Cyanobacteria اشاره کرد که کمترین میزان تغییرات را دارد. درنتیجه احتمال ایجاد مقاومت دارویی مربوط به پروتئین RecA در جنس و گونه‌های این فایلوم کمتر از دیگر فایلوم‌های موجود در این پژوهش است. نتایج به‌دست‌آمده در این پژوهش ممکن است به گونه‌ای دیگر هم تفسیر شود. بنابراین می‌خواهیم به استنباط خود از این نتایج به صورت یک فرضیه اشاره کنیم. البته بررسی‌های بیشتر در کارهایی برای مطالعات آینده می‌تواند به شفاف‌سازی بیشتر این استنباط کمک کند.
متن کامل: (6204 مشاهده)
مقدمه
سرعت تغییرات ژن‌های مختلف در طول تکامل با یکدیگر متفاوت است. به طور مثال ژن 16SrRNA یکی از حفظ‌شده‌ترین ژن‌هایی است که کمترین تغییرات را در طول تکامل خود داشته است. اما سؤال اینجاست که در مقایسه با ژن 16SrRNA، ژن‌های دیگر یا پروتئین آنها، چه مقدار تغییرات را در فایلوم‌های مختلف جانداران طی تکامل نشان می‌دهند و یا تفاوت این تغییرات در فایلوم‌های مختلف موجودات زنده در مقایسه با ژن 16SrRNA آنها چگونه است. سؤالات به وجود آمده باعث انجام پژوهش‌هایی در این زمینه شده است که در ادامه میزان تغییرات خانواده پروتئینی RecA باکتریایی را در مقایسه با ژن 16SrRNA با استفاده از درخت تاکسونومی بررسی می‌کنیم.
پروتئین RecA باکتریایی برای نوترکیبی همولوگ و ترمیم DNA آسیب‌دیده ضروری است. درنتیجه این خانواده پروتئینی در مطالعات مباحث مربوط به ژنتیک میکروبی نقش عمده‌ای دارد (1). بر این اساس نبود خانواده پروتئینی RecA به علت تجمع جهش‌های مضر باعث مرگ باکتری می‌شود (2). RecA فعالیت‌های زیادی دارد که شامل اتصال به DNA تک‌رشته‌ای و دو رشته‌ای، هیدرولیز ATP و ترمیم DNA با روش نوترکیبی همولوگ است. همچنین برای محافظت از ژنوم و تنوع ژنتیکی به‌خصوص در یوکاریوت‌ها اهمیت دارد و برای میوز ضروری است. این پروتئین برای شروع نوترکیبی همولوگ، دومینی را که جایگاه اتصال ATP دارد، روی DNA تک‌رشته آسیب‌دیده قرار می‌دهد و با اتصال ATP به این جایگاه، ترمیم آغاز می‌شود (3). RecA حدوداً 350 آسید امینه دارد که توالی آن در بین گونه‌های باکتریایی بسیار حفظ شده است. معادل هومولگ پروتئین RecA باکتریایی در یوکاریوت‌ها Rad51، DMC1 و در آرکی‌باکتر‌ها RadA، RadB نامیده می‌شود (4، 5).
در پژوهشی که در سال 1996 در دانشگاه استنفورد آمریکا انجام شد، پروتئین‌های مختلف خانواده RecA را با یکدیگر مقایسه کردند. به این صورت که پروتئین RecA باکتریایی به عنوان گروه اول و Rad51/DMC1 در یوکاریوت‌ها و RadA در آرکی‌باکتر‌ها را به عنوان گروه دوم در نظر گرفتند. برای راحت خوانده‌شدن پروتئین‌های گروه دوم، حروف اول هر پروتئین را در نظر گرفتند و گروه دوم را به اختصار RDR نام‌گذاری کردند. در آن پژوهش همترازسازی چندگانه برای توالی‌های انتخاب‌شده RDR انجام شد و نتایج را به صورت امتیاز ارائه دادند. نتایج این همترازسازی چندگانه نشان داد 6 بلاک (قطعه‌ای از توالی که حفظ شده است) مشترک در میان توالی‌های RDR وجود دارد. سپس 6 بلاک حفظشده توالیها را استخراج کردند که این کار برای همترازسازی توالی‌های RDR با توالی پروتئین RecA بسیار مناسب بود. در مرحله بعد یک همترازسازی چندگانه بین بلاک‌های مشترک پروتئین‌های RDR با پروتئین RecA صورت گرفت. نتایج حاصل از همترازسازی نشان داد پروتئین‌های RDR شباهت بیشتری به یکدیگر در مقایسه با پروتئین RecA دارند، اما همچنان این سه پروتئین با پروتئین RecA باکتریایی همولوگ هستند (6).
تاکسونومی باکتری‌ها در اواخر قرن 19 آغاز شد؛ زمانی که ویژگی‌های فنوتیپی، محیط کشت، مورفولوژی، اندازه کلونی و رنگ واکنش‌های شیمایی برای توصیف باکتری لازم بود (7). به عبارت دیگر، رویکردهای اولیه برای ایجاد درخت تکاملی موجودات، بر اساس ویژگی‌های فیزیکی و متابولیکی بوده است. امروزه روش‌های مولکولی به سرعت گسترش یافته است و این گسترش شامل ایجاد تنوع در ارائه درخت زندگی (تکاملی) نیز می‌شود، زیرا سازماندهی درخت‌ها با مشاهده مستقیم و آزمایش روی توالی ژن‌ها صورت می‌گیرد (8). درخت تاکسونومی اطلاعات ضروری را برای دانشمندان فراهم می‌کند تا با استفاده از این اطلاعات به رابطه درستی بین زندگی میکروارگانیسم‌ها و محیط زیست مختلف آنها برسند (9).
ژن‌های rRNA برای زنده‌ماندن همه موجودات ضروری هستند و همچنین توالی بازهای آلی در این ژن‌ها به شدت حفظ شده است. به همین علت تعیین توالی بازهای آلی ژن 16SrRNA به عنوان یک روش استاندارد برای شناسایی گونه‌ها، جنس‌ها و خانواده باکتری‌ها به کار می‌رود. امروزه روشن است که تجزیه و تحلیل توالی‌های ژن 16SrRNA اهمیت زیادی دارد. تجزیه و تحلیل توالی ژن rRNA عمل قدرتمندی برای به‌دست‌آوردن تاکسونومی‌های میکروبی است (10، 11).
در پژوهشی که سال 2017 انجام شد، برای شناسایی و طبقه‌بندی دقیق گونه‌های مایکوباکتریوم از شباهت توالی ژن 16SrRNA آنها استفاده شد (12). در آن پژوهش پس از جداسازی توالی‌های 16SrRNA برای به‌دست‌آوردن بیشترین و کمترین مقدار شباهت بین تمام گونه‌های مایکوباکتریوم، از الگوریتم muscle برای همترازسازی دوگانه و از الگوریتم likelihood برای ترسیم درخت استفاده شد (13، 14). نتایج حاصل نشان داد گونه M.porifera از خانواده مایکوباکتریوم کمترین شباهت را به گونه‌های دیگر از این خانواده باکتریایی دارد (12).
در پژوهشی دیگر به مقایسه درخت فیلوژنی ژن 16SrRNA و RecA از گونه‌های یکسان پرداختند که آنالیز تکاملی ژن RecA با روش‌های فیلوژنی مولکولی صورت گرفت. برای ترسیم درخت فیلوژنی از توالی‌های باکتریایی پروتئین RecA و توالی‌های 16SrRNA از جنس و گونه یکسان استفاده شد و برای گونه‌هایی که توالی شناخته‌شده نداشتند، از توالی گونه‌های نزدیکش استفاده کردند. در مواردی که توالی کامل برای ژن 16SrRNA وجود نداشت، از توالی‌های ناقص (Partial) آن گونه استفاده شد. درخت‌های فیلوژنی تولیدشده، حاصل همترازسازی چندگانه توالیها هستند و با استفاده از الگوریتم Neighbor-joining به دست آمده‌اند. بیشترین تفاوت میان درختان RecA و rRNA مربوط به پروتئوباکترها است. طبق این مطالعات مشخص شد پروتئین RecA می‌تواند برای مطالعات مولکولی مفید باشد (15).
در پژوهش حاضر نیز به علت اهمیت میکروب‌شناسی پزشکی و مباحث تکاملی مربوط به خانواده پروتئینی RecA، سرعت تغییرات فایلوم‌های منتخب این خانواده پروتئینی در مقایسه با فایلوم‌های یکسان در ژن 16SrRNA با استفاده از تعیین شاخص AAS (میانگین امتیاز همترازی) بررسی شد. به‌دست‌آوردن سرعت تغییرات می‌تواند کمک شایانی در زمینه مقاومت دارویی برای جنس و گونه‌های فایلوم‌های مذکور انجام دهد.
پروتئین RecA باکتریایی برای نوترکیبی همولوگ و ترمیم DNA آسیب‌دیده ضروری است. درنتیجه این خانواده پروتئینی در مطالعات مباحث مربوط به ژنتیک میکروبی نقش عمده‌ای دارد (1). بر این اساس نبود خانواده پروتئینی RecA به علت تجمع جهش‌های مضر باعث مرگ باکتری می‌شود (2). RecA فعالیت‌های زیادی دارد که شامل اتصال به DNA تک‌رشته‌ای و دو رشته‌ای، هیدرولیز ATP و ترمیم DNA با روش نوترکیبی همولوگ است. همچنین برای محافظت از ژنوم و تنوع ژنتیکی به‌خصوص در یوکاریوت‌ها اهمیت دارد و برای میوز ضروری است. این پروتئین برای شروع نوترکیبی همولوگ، دومینی را که جایگاه اتصال ATP دارد، روی DNA تک‌رشته آسیب‌دیده قرار می‌دهد و با اتصال ATP به این جایگاه، ترمیم آغاز می‌شود (3). RecA حدوداً 350 آسید امینه دارد که توالی آن در بین گونه‌های باکتریایی بسیار حفظ شده است. معادل هومولگ پروتئین RecA باکتریایی در یوکاریوت‌ها Rad51، DMC1 و در آرکی‌باکتر‌ها RadA، RadB نامیده می‌شود (4، 5).
در پژوهشی که در سال 1996 در دانشگاه استنفورد آمریکا انجام شد، پروتئین‌های مختلف خانواده RecA را با یکدیگر مقایسه کردند. به این صورت که پروتئین RecA باکتریایی به عنوان گروه اول و Rad51/DMC1 در یوکاریوت‌ها و RadA در آرکی‌باکتر‌ها را به عنوان گروه دوم در نظر گرفتند. برای راحت خوانده‌شدن پروتئین‌های گروه دوم، حروف اول هر پروتئین را در نظر گرفتند و گروه دوم را به اختصار RDR نام‌گذاری کردند. در آن پژوهش همترازسازی چندگانه برای توالی‌های انتخاب‌شده RDR انجام شد و نتایج را به صورت امتیاز ارائه دادند. نتایج این همترازسازی چندگانه نشان داد 6 بلاک (قطعه‌ای از توالی که حفظ شده است) مشترک در میان توالی‌های RDR وجود دارد. سپس 6 بلاک حفظشده توالیها را استخراج کردند که این کار برای همترازسازی توالی‌های RDR با توالی پروتئین RecA بسیار مناسب بود. در مرحله بعد یک همترازسازی چندگانه بین بلاک‌های مشترک پروتئین‌های RDR با پروتئین RecA صورت گرفت. نتایج حاصل از همترازسازی نشان داد پروتئین‌های RDR شباهت بیشتری به یکدیگر در مقایسه با پروتئین RecA دارند، اما همچنان این سه پروتئین با پروتئین RecA باکتریایی همولوگ هستند (6).
تاکسونومی باکتری‌ها در اواخر قرن 19 آغاز شد؛ زمانی که ویژگی‌های فنوتیپی، محیط کشت، مورفولوژی، اندازه کلونی و رنگ واکنش‌های شیمایی برای توصیف باکتری لازم بود (7). به عبارت دیگر، رویکردهای اولیه برای ایجاد درخت تکاملی موجودات، بر اساس ویژگی‌های فیزیکی و متابولیکی بوده است. امروزه روش‌های مولکولی به سرعت گسترش یافته است و این گسترش شامل ایجاد تنوع در ارائه درخت زندگی (تکاملی) نیز می‌شود، زیرا سازماندهی درخت‌ها با مشاهده مستقیم و آزمایش روی توالی ژن‌ها صورت می‌گیرد (8). درخت تاکسونومی اطلاعات ضروری را برای دانشمندان فراهم می‌کند تا با استفاده از این اطلاعات به رابطه درستی بین زندگی میکروارگانیسم‌ها و محیط زیست مختلف آنها برسند (9).
ژن‌های rRNA برای زنده‌ماندن همه موجودات ضروری هستند و همچنین توالی بازهای آلی در این ژن‌ها به شدت حفظ شده است. به همین علت تعیین توالی بازهای آلی ژن 16SrRNA به عنوان یک روش استاندارد برای شناسایی گونه‌ها، جنس‌ها و خانواده باکتری‌ها به کار می‌رود. امروزه روشن است که تجزیه و تحلیل توالی‌های ژن 16SrRNA اهمیت زیادی دارد. تجزیه و تحلیل توالی ژن rRNA عمل قدرتمندی برای به‌دست‌آوردن تاکسونومی‌های میکروبی است (10، 11).
در پژوهشی که سال 2017 انجام شد، برای شناسایی و طبقه‌بندی دقیق گونه‌های مایکوباکتریوم از شباهت توالی ژن 16SrRNA آنها استفاده شد (12). در آن پژوهش پس از جداسازی توالی‌های 16SrRNA برای به‌دست‌آوردن بیشترین و کمترین مقدار شباهت بین تمام گونه‌های مایکوباکتریوم، از الگوریتم muscle برای همترازسازی دوگانه و از الگوریتم likelihood برای ترسیم درخت استفاده شد (13، 14). نتایج حاصل نشان داد گونه M.porifera از خانواده مایکوباکتریوم کمترین شباهت را به گونه‌های دیگر از این خانواده باکتریایی دارد (12).
در پژوهشی دیگر به مقایسه درخت فیلوژنی ژن 16SrRNA و RecA از گونه‌های یکسان پرداختند که آنالیز تکاملی ژن RecA با روش‌های فیلوژنی مولکولی صورت گرفت. برای ترسیم درخت فیلوژنی از توالی‌های باکتریایی پروتئین RecA و توالی‌های 16SrRNA از جنس و گونه یکسان استفاده شد و برای گونه‌هایی که توالی شناخته‌شده نداشتند، از توالی گونه‌های نزدیکش استفاده کردند. در مواردی که توالی کامل برای ژن 16SrRNA وجود نداشت، از توالی‌های ناقص (Partial) آن گونه استفاده شد. درخت‌های فیلوژنی تولیدشده، حاصل همترازسازی چندگانه توالیها هستند و با استفاده از الگوریتم Neighbor-joining به دست آمده‌اند. بیشترین تفاوت میان درختان RecA و rRNA مربوط به پروتئوباکترها است. طبق این مطالعات مشخص شد پروتئین RecA می‌تواند برای مطالعات مولکولی مفید باشد (15).
در پژوهش حاضر نیز به علت اهمیت میکروب‌شناسی پزشکی و مباحث تکاملی مربوط به خانواده پروتئینی RecA، سرعت تغییرات فایلوم‌های منتخب این خانواده پروتئینی در مقایسه با فایلوم‌های یکسان در ژن 16SrRNA با استفاده از تعیین شاخص AAS (میانگین امتیاز همترازی) بررسی شد. به‌دست‌آوردن سرعت تغییرات می‌تواند کمک شایانی در زمینه مقاومت دارویی برای جنس و گونه‌های فایلوم‌های مذکور انجام دهد.
مواد و روش‌ها
انتخاب توالی
در آغاز این پژوهش توالی‌های خانواده پروتئینی RecA با استفاده از پایگاه داده پروسایت (https://prosite.expasy.org) استخراج و ذخیره‌سازی شدند (16). سپس جداسازی توالی‌های باکتریایی پروتئینی RecA از بین بقیه پروتئین‌های این خانواده صورت گرفت. به منظور کاهش خطا در رسم درخت تکاملی با دسته‌بندی‌کردن توالیها، تعداد جنس و گونه‌های منتخب برای این پژوهش محدود شد. دسته‌بندی توالیها با سرور سی دی هیت (http://weizhongli-lab.org/cd-hit/) انجام شد (17). این ابزار توالی‌های مشابه را در یک کلاستر (دسته) قرار می‌دهد و به ما کمک می‌کند تا از هر کدام از این کلاستر‌ها بتوانیم یک توالی یا یک جنس و گونه را به عنوان نماینده انتخاب کنیم. به این ترتیب تعداد توالی‌هایی که برای رسم درخت تکاملی یک خانواده پروتئینی لازم است، کاهش می‌یابد. این برنامه قابلیت کلاستربندی میلیون‌ها توالی استخراج‌شده از پایگاه داده‌های اطلاعات را دارد که مربوط به یک خانواده بزرگ پروتئینی هستند. توالیها در ابتدا با کاهش طول مرتب می‌شوند، و بلندترین توالی به عنوان نماینده یا سرگروه انتخاب می‌شود. سپس هر توالی باقی‌مانده با نماینده موجود مقایسه می‌شود. اگر شباهت توالی با اولین توالی نماینده بیشتر از حد آستانه تعیین‌شده باشد، بدون مقایسه با دیگر نماینده‌ها وارد یک کلاستر پروتئینی می‌شود؛ در غیر این صورت آن توالی به عنوان یک نماینده محسوب می‌شود. این نرم‌افزار با استفاده از الگوریتم پایه به نام فیلترینگ کلمه کوتاه (Short word filtering ) میزان شباهت توالیها را با توجه به حد آستانه تعیین‌شده، مشخص و کلاستربندی می‌کند (18).
شکل شماتیک، مراحل انجام کار به صورت خلاصه را نشان می‌دهد.
نتیجه استفاده از Cd-hit با حد آستانه 0/75 برای کل توالی‌های باکتریایی RecA ،تعداد 104 کلاستر بود که 40 کلاستر از آنها به صورت تک‌عضوی بودند. در مرحله بعد سرگروه‌های مربوط به هر کلاستر انتخاب شد. به منظور یافتن توالی ژن 16SrRNA کامل آنها از پایگاه داده نوکلوتیدی NCBI استفاده شد. برای کلاستر‌های بزرگ‌تر که سرگروه آنها توالی 16SrRNA کامل نداشتند، از دیگر اعضای کلاستر استفاده شد. درنتیجه 30 توالی برای پروتئین RecA و30 توالی نوکلوتیدی 16SrRNA کامل از جنس و گونه یکسان به دست آمد. هر یک از این توالیها به نمایندگی از دیگر اعضای کلاسترشان به دلیل شباهت زیاد و داشتن ژن کامل 16SrRNA انتخاب شدند و باقی کلاستر‌ها به دلیل نداشتن توالی کامل ژن 16SrRNA و تک‌توالی بودن در کلاسترشان در این پژوهش استفاده نشدند.
استخراج درخت تاکسونومی و محاسبه درخت 16 اس-تاکسونومی برای 30 گونه انتخابی
درخت تاکسونومی مربوط به 30 جنس و گونه انتخابی از بخش NCBI Taxonomy Browser استخراج شد (19). برای مشخص‌شدن صحت جایگاه تکاملی هر کدام از شاخه‌های اصلی و زیرشاخه‌های درخت تاکسونومی، همترازسازی‌های دوگانه میان توالی‌های ژن 16SrRNA درون‌شاخه‌ای و بین‌شاخه‌ای صورت گرفت. برای این منظور در ابتدا با استفاده از نرم‌افزار جلویو (Jalview) برای توالی‌های هر یک از زیرشاخه‌های موجود در شاخه اصلی با توالی‌های همان شاخه همترازسازی دوگانه انجام شد. در ادامه مشخص شد هر کدام از شاخه‌های اصلی درخت تاکسونومی مربوط به یک فایلوم (Phylum) باکتریایی هستند (شکل 2). در مرحله بعد به منظور بررسی جایگاه تکاملی صحیح 8 شاخه اصلی در درخت تاکسونومی، از هر شاخه یک توالی به عنوان نماینده انتخاب شد و با هریک از نماینده‌های 7 شاخه دیگر همترازسازی صورت گرفت. توالی‌ای که کمترین مجموع امتیاز همترازسازی را نسبت به مجموع امتیاز همترازسازی دیگر نماینده‌ها گرفت، به عنوان توالی مرجع درخت انتخاب شد که در این پژوهش توالی شماره 18 از درخت تاکسونومی است.
محاسبه شاخص میانگین امتیاز همترازی به منظور تعیین چینش شاخه‌های اصلی در درخت تاکسونومی
برای محاسبه شاخص میانگین امتیاز همترازسازی برای هر یک از 7 شاخه اصلی درخت 16S-تاکسونومی از رابطه زیر استفاده می‌شود.
فرمول:
در این رابطه AAS مخفف Average Alignment Score و AAS(X) نشان‌دهنده میانگین امتیاز همترازی شاخه‌های فرعی i در هر شاخه اصلی X است. همچنین n نشان‌دهنده تعداد شاخه‌های فرعی i در هر شاخه اصلی X است. در این رابطه axi نشان‌دهنده امتیاز همترازی هر شاخه فرعی i در یک شاخه اصلی X با توالی مرجع است.
توالی مرجع درخت، توالی ژن 16SrRNA کامل از جنس و گونه Bacteroides fringlis است که در بالای درخت 16S-تاکسونومی (شکل 3) با شماره 18 قابل مشاهده است. از این رابطه به منظور چینش 7 شاخه اصلی دیگر استفاده می‌شود. به این صورت که برای توالی‌های هر فایلوم با توالی مرجع همترازسازی دوگانه صورت گرفت و مقدار AAS برای هر فایلوم محاسبه شد. سپس بر اساس بیشترین مقدار تا کمترین مقدار AAS، فایلوم‌ها مرتب شدند. نتیجه به‌دست‌آمده درخت 16S-تاکسونومی نامیده شد. در ادامه میانگین امتیاز همترازسازی برای توالی فایلوم‌های پروتئینی RecA محاسبه شد؛ با این تفاوت که به منظور بررسی مقدار تغییرات پروتئین RecA در مقایسه با ژن 16SrRNA، جایگاه فایلوم‌های پروتئین RecA همانند فایلوم‌های درخت 16S-تاکسونومی در نظر گرفته شد.
استخراج درخت تاکسونومی و محاسبه درخت 16 اس-تاکسونومی برای 30 گونه انتخابی
درخت تاکسونومی مربوط به 30 جنس و گونه انتخابی از بخش NCBI Taxonomy Browser استخراج شد (19). برای مشخص‌شدن صحت جایگاه تکاملی هر کدام از شاخه‌های اصلی و زیرشاخه‌های درخت تاکسونومی، همترازسازی‌های دوگانه میان توالی‌های ژن 16SrRNA درون‌شاخه‌ای و بین‌شاخه‌ای صورت گرفت. برای این منظور در ابتدا با استفاده از نرم‌افزار جلویو (Jalview) برای توالی‌های هر یک از زیرشاخه‌های موجود در شاخه اصلی با توالی‌های همان شاخه همترازسازی دوگانه انجام شد. در ادامه مشخص شد هر کدام از شاخه‌های اصلی درخت تاکسونومی مربوط به یک فایلوم (Phylum) باکتریایی هستند (شکل 2). در مرحله بعد به منظور بررسی جایگاه تکاملی صحیح 8 شاخه اصلی در درخت تاکسونومی، از هر شاخه یک توالی به عنوان نماینده انتخاب شد و با هریک از نماینده‌های 7 شاخه دیگر همترازسازی صورت گرفت. توالی‌ای که کمترین مجموع امتیاز همترازسازی را نسبت به مجموع امتیاز همترازسازی دیگر نماینده‌ها گرفت، به عنوان توالی مرجع درخت انتخاب شد که در این پژوهش توالی شماره 18 از درخت تاکسونومی است.
محاسبه شاخص میانگین امتیاز همترازی به منظور تعیین چینش شاخه‌های اصلی در درخت تاکسونومی
برای محاسبه شاخص میانگین امتیاز همترازسازی برای هر یک از 7 شاخه اصلی درخت 16S-تاکسونومی از رابطه زیر استفاده می‌شود.
فرمول:
در این رابطه AAS مخفف Average Alignment Score و AAS(X) نشان‌دهنده میانگین امتیاز همترازی شاخه‌های فرعی i در هر شاخه اصلی X است. همچنین n نشان‌دهنده تعداد شاخه‌های فرعی i در هر شاخه اصلی X است. در این رابطه axi نشان‌دهنده امتیاز همترازی هر شاخه فرعی i در یک شاخه اصلی X با توالی مرجع است.
توالی مرجع درخت، توالی ژن 16SrRNA کامل از جنس و گونه Bacteroides fringlis است که در بالای درخت 16S-تاکسونومی (شکل 3) با شماره 18 قابل مشاهده است. از این رابطه به منظور چینش 7 شاخه اصلی دیگر استفاده می‌شود. به این صورت که برای توالی‌های هر فایلوم با توالی مرجع همترازسازی دوگانه صورت گرفت و مقدار AAS برای هر فایلوم محاسبه شد. سپس بر اساس بیشترین مقدار تا کمترین مقدار AAS، فایلوم‌ها مرتب شدند. نتیجه به‌دست‌آمده درخت 16S-تاکسونومی نامیده شد. در ادامه میانگین امتیاز همترازسازی برای توالی فایلوم‌های پروتئینی RecA محاسبه شد؛ با این تفاوت که به منظور بررسی مقدار تغییرات پروتئین RecA در مقایسه با ژن 16SrRNA، جایگاه فایلوم‌های پروتئین RecA همانند فایلوم‌های درخت 16S-تاکسونومی در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
همان‌طور که در بخش روش کار قسمت انتخاب توالی توضیح داده شد، با استفاده از پایگاه داده پروسایت توالی‌های خانواده پروتئینی RecA استخراج شدند و پس از دسته‌بندی از میان 104 کلاستر حاصل‌شده، 30 گونه به عنوان جنس و گونه‌های نماینده انتخاب شدند. هدف اصلی این پژوهش تعیین میزان تغییرات در پروتئین‌های RecA در طول زمان تکاملی آنها در مقایسه با حفظ‌شده‌ترین ژن شناخته‌شده بود که به صورت کلاسیک ژن 16SrRNA معرفی می‌شود. بر پایه این هدف می‌توان به گونه‌هایی که سرعت تغییرات پروتئین RecA آنها بیشترین و کمترین مقدار بوده است، دست پیدا کرد. به این ترتیب می‌توان تعیین کرد سرعت تغییرات برای ژن مربوط به پروتئین RecA باکتریایی در کدام گونه بسیار زیاد و در کدام گونه بسیار کم است. این مسئله می‌تواند نوعی پیشگویی برای یکی از دلایل ایجاد مقاومت باکتری‌ها به دارو‌ها طی زمان طولانی باشد. به طور اساسی تعیین میزان تغییرات در پروتئین RecA باکتریایی در گونه‌های مختلف به طور مستقل اطلاعات پایه‌ای مهمی را در اختیار ما قرار می‌دهد.
درخت تاکسونومی حاصل برای 30 گونه انتخابی
برای به‌دست‌آوردن رابطه تکاملی میان گونه‌های انتخابی، در قدم اول درخت تاکسونومی از Taxonomy browser پایگاه داده NCBI استخراج شد. شکل 1 درخت تاکسونومی مربوط به 30 گونه انتخابی را نشان می‌دهد. در این درخت 8 شاخه اصلی دیده می‌شود که هر کدام از آنها مربوط به یک فایلوم باکتریایی مجزاست. سؤال مهمی که اینجا مطرح است این است که ترتیب شاخه‌های اصلی باید چگونه باشد؛ یعنی کدام شاخه قدیمی‌تر است و کدام شاخه‌‌ها باید پس از آن قرار داده شوند؟
برای اصلاح ترتیب شاخه‌های اصلی درخت تاکسونومی، باید یک قاعده مناسب تعیین شود. به این منظور از توالی کامل 16SrRNA مربوط به 30 گونه انتخابی استفاده شد. برای پیداکردن و استفاده از یک قاعده مناسب مراحل زیر به ترتیب انجام شد:
1. کسب اطمینان از صحیح‌بودن جایگاه تکاملی شاخه‌های فرعی درون هر شاخه اصلی اطمینان حاصل شد.
به این منظور دو بررسی صورت گرفت. در اولین بررسی، رده‌بندی‌های تاکسونومی 30 گونه انتخابی با استفاده از مرورگر تاکسونومی ان سی بی ای (NCBI Taxonomy Browser) استخراج و به تفکیک شاخه‌های اصلی، دسته‌بندی شدند. نتیجه این بررسی در شکل 2 قابل مشاهده است. همان‌طور که در شکل 2 دیده می‌شود، گونه‌های موجود در هر شاخه اصلی، حداقل از بخش فایلوم با یکدیگر مشابه هستند. البته در بعضی از شاخه‌های اصلی میزان این شباهت تا رده‌های پایین‌تر ادامه پیدا می‌کند.
شکل 1. درخت تاکسونومی استخراج‌شده از پایگاه داده NCBI، 8 شاخه اصلی دارد. اعداد قرمز در شکل نشان‌دهنده شماره‌گذاری شاخه اصلی و اعداد سیاه نشان‌دهنده شاخه‌های فرعی هستند. همان‌طور که از روی درخت تاکسونومی می‌توان تشخیص داد، در بعضی از فایلوم‌ها چند گونه و در بعضی از آنها فقط یک گونه قرار گرفته است.
شکل 2. رده‌بندی تکاملی برای 30 گونه انتخابی. در این شکل تاکسونومی زیرشاخه‌های هر شاخه اصلی با ایجاد فاصله از یکدیگر جدا شده‌اند. شماره‌گذاری‌ای که در سمت چپ رده‌بندی هر گونه دیده می‌شود، با شماره‌گذاری درخت مربوط به شکل 1 مطابقت دارد. در این پژوهش شاخه‌های اصلی را فایلوم نامیده‌ایم.
در دومین بررسی میزان شباهت توالی‌های ژن 16SrRNA شاخه‌های فرعی در هر شاخه اصلی، بعد از انجام 73 همترازسازی محاسبه شد. نتایج این بررسی به این صورت به دست آمد که میانگین امتیاز همترازسازی توالی‌های درون فایلومی شاخه‌های اصلی با شماره شاخه‌های 2، 3، 4، 5، 7 و 8 برابر شد با 2117، 1537، 2202، 1711، 1481 و 1500. شاخه‌های اصلی 1 و 6 به دلیل تک‌توالی‌بودن در این محاسبه استفاده نشد.
همچنین میانگین امتیاز همترازسازی خارج فایلومی برای هر یک از شاخه‌های ذکرشده برابر شد با 1149، 1023، 1255، 1202، 1184 و 1113. همان‌طور که قابل ملاحظه است میانگین امتیاز همترازسازی درون فایلومی هر شاخه اصلی عددی بیشتر را نسبت به میانگین امتیاز همترازسازی خارج فایلومی نشان می‌دهد. بنابراین به طور نسبی می‌توان گفت که در این درخت تاکسونومی، شاخه‌های فرعی در هر شاخه اصلی، به طور صحیحی قرار گرفتند.
2. بررسی صحت جایگاه تکاملی هر شاخه اصلی در درخت تاکسونومی
با توجه به درخت تاکسونومی شکل 1، به منظور بررسی جایگاه شاخه‌های اصلی که آیا از نظر تکاملی ترتیب درستی دارند یا خیر، میانگین امتیاز همترازسازی برای توالی‌های هر فایلوم با توالی شماره 1 درخت تاکسونومی که گونه Thermotogae است محاسبه شد و نتیجه آن در شکل 3 قابل ملاحظه است.
همچنین میانگین امتیاز همترازسازی خارج فایلومی برای هر یک از شاخه‌های ذکرشده برابر شد با 1149، 1023، 1255، 1202، 1184 و 1113. همان‌طور که قابل ملاحظه است میانگین امتیاز همترازسازی درون فایلومی هر شاخه اصلی عددی بیشتر را نسبت به میانگین امتیاز همترازسازی خارج فایلومی نشان می‌دهد. بنابراین به طور نسبی می‌توان گفت که در این درخت تاکسونومی، شاخه‌های فرعی در هر شاخه اصلی، به طور صحیحی قرار گرفتند.
2. بررسی صحت جایگاه تکاملی هر شاخه اصلی در درخت تاکسونومی
با توجه به درخت تاکسونومی شکل 1، به منظور بررسی جایگاه شاخه‌های اصلی که آیا از نظر تکاملی ترتیب درستی دارند یا خیر، میانگین امتیاز همترازسازی برای توالی‌های هر فایلوم با توالی شماره 1 درخت تاکسونومی که گونه Thermotogae است محاسبه شد و نتیجه آن در شکل 3 قابل ملاحظه است.
شکل 3. ستون‌های این نمودار بیانگر میزان امتیاز همترازسازی میان توالی فایلوم‌های درخت تاکسونومی با اولین توالی این درخت است.
با توجه به نمودار 1 می‌توان دریافت که نمودار، روند کاهشی را دنبال نمی‌کند و این نشانگر آن است که جایگاه شاخه‌های اصلی به صورت تصادفی قرار گرفته است و به صورت تکاملی نیست.
3. مرحله اصلی در اصلاح جایگاه شاخه‌های اصلی درخت تاکسونومی
همان‌طور که در بخش روش کار توضیح داده شد، با استفاده از شاخص AAS میانگین امتیاز همترازسازی توالی‌های هر فایلوم با توالی سرگروه محاسبه شد. چگونگی انتخاب سرگروه درخت که توالی شماره 18و گونه Bacteroides درخت تاکسونومی است در بخش سوم روش کار توضیح داده شده است. فایلومی که بیشترین مقدار AAS را داشت، بعد از توالی سرگروه قرار گرفت. فایلوم‌ها براساس بیشترین تا کمترین مقدار AAS در درخت تاکسونومی مرتب شدند. حاصل این چینش درخت 16S-تاکسونومی نامیده شد (شکل 3).
طبق چینش انجام‌شده فایلوم Bacteroidetes به عنوان سرگروه درخت انتخاب شد و پس از آن به ترتیب فایلوم‌های Actinobacteria، Firmicutes، Cyanobacteria، Deinococus-thermus، Epsilonsubdivision، Alphaproteobacteria، Gammaproteobacteria، Termotogae بعد از سرگروه قرار گرفتند (اسامی از چپ به راست خوانده شود).
تعیین روشی دقیق و مناسب برای چینش شاخه‌های اصلی درخت تاکسونومی پیچیده است، اما ترتیبی که در شکل 3 ارائه داده شده است، بر مبنای ژن 16SrRNA است و بی‌شک نتیجه‌ای بهتر از خروجی درخت تاکسونومی NCBI در ترتیب شاخه‌های اصلی به ما می‌دهد. ترسیم یک درخت تکاملی صحیح که ارتباط دقیق تکاملی جنس و گونه‌های مختلف را به ما بدهد مسئله‌ای حل‌نشده است. بر اساس نتایجی که در این پژوهش به دست آمده و بررسی‌هایی که انجام شده است، الگوریتم‌های موجود برای به‌دست‌آوردن درخت‌های فیلوژنی مانند الگوریتم neighbour joining و UMGMA روی 30 گونه انتخابی ژن 16SrRNA ، نتایجی می‌دهد که هم با یکدیگر و هم با درخت تاکسونومی NCBI متفاوت است.
3. مرحله اصلی در اصلاح جایگاه شاخه‌های اصلی درخت تاکسونومی
همان‌طور که در بخش روش کار توضیح داده شد، با استفاده از شاخص AAS میانگین امتیاز همترازسازی توالی‌های هر فایلوم با توالی سرگروه محاسبه شد. چگونگی انتخاب سرگروه درخت که توالی شماره 18و گونه Bacteroides درخت تاکسونومی است در بخش سوم روش کار توضیح داده شده است. فایلومی که بیشترین مقدار AAS را داشت، بعد از توالی سرگروه قرار گرفت. فایلوم‌ها براساس بیشترین تا کمترین مقدار AAS در درخت تاکسونومی مرتب شدند. حاصل این چینش درخت 16S-تاکسونومی نامیده شد (شکل 3).
طبق چینش انجام‌شده فایلوم Bacteroidetes به عنوان سرگروه درخت انتخاب شد و پس از آن به ترتیب فایلوم‌های Actinobacteria، Firmicutes، Cyanobacteria، Deinococus-thermus، Epsilonsubdivision، Alphaproteobacteria، Gammaproteobacteria، Termotogae بعد از سرگروه قرار گرفتند (اسامی از چپ به راست خوانده شود).
تعیین روشی دقیق و مناسب برای چینش شاخه‌های اصلی درخت تاکسونومی پیچیده است، اما ترتیبی که در شکل 3 ارائه داده شده است، بر مبنای ژن 16SrRNA است و بی‌شک نتیجه‌ای بهتر از خروجی درخت تاکسونومی NCBI در ترتیب شاخه‌های اصلی به ما می‌دهد. ترسیم یک درخت تکاملی صحیح که ارتباط دقیق تکاملی جنس و گونه‌های مختلف را به ما بدهد مسئله‌ای حل‌نشده است. بر اساس نتایجی که در این پژوهش به دست آمده و بررسی‌هایی که انجام شده است، الگوریتم‌های موجود برای به‌دست‌آوردن درخت‌های فیلوژنی مانند الگوریتم neighbour joining و UMGMA روی 30 گونه انتخابی ژن 16SrRNA ، نتایجی می‌دهد که هم با یکدیگر و هم با درخت تاکسونومی NCBI متفاوت است.
شکل 3. درخت 16S-تاکسونومی. این درخت بر اساس میانگین امتیاز همترازی شاخه‌های فرعی هر فایلوم با فایلوم سرگروه به دست آمده است.
در شکل 4، متوسط امتیاز همترازسازی توالی‌های هر فایلوم با فایلوم سرگروه قابل ملاحظه است. همان‌طور که انتظار می‌رفت نمودار سیر نزولی را دنبال می‌کند و فایلوم Thermotogae با کمترین میزان میانگین (838) در دورترین فاصله تکاملی نسبت به سرگروه قرار گرفته است و فایلوم Actinobacteria با میانگین امتیاز 952/5 نزدیک‌ترین فایلوم به سرگروه است که نشان‌دهنده شباهت بیشتر این فایلوم از نظر تکاملی با سرگروه است. این روند نشان داده است هرچه توالیها از سرگروه فاصله می‌گیرند، میزان شباهت و امتیاز آنها کمتر می‌شود. همچنین میزان شباهت از فایلوم دوم به سوم به طور چشمگیری کاهش یافته است که این امر بیانگر تغییرات ناگهانی تکاملی در این فایلوم‌ها است. در ادامه برای توالی‌های پروتئین RecA محاسبات مشابه با موارد توضیح‌داده‌شده برای ژن 16srRNA انجام شد.
آنالیز توالی‌های RecA برای تعیین فاصله تکاملی
هدف اصلی این پژوهش به‌دست‌آوردن فاصله تکاملی توالی‌های منتخب RecA از خانواده پروتئینی RecA در مقایسه با توالی‌های ژن 16srRNA همان جنس و گونه‌ها بوده است. به این منظور جایگاه فایلوم‌های پروتئینی RecA را با فایلوم‌های ژن 16srRNA در درخت 16S-تاکسونومی یکسان قرار داده شد. سپس توالی‌های آمینواسیدی هر فایلوم با توالی فایلوم سرگروه (Bacteroides) همترازسازی و مقدار AAS برای هر فایلوم محاسبه شد. نتایح حاصل از این محاسبات برای خانواده RecA در شکل 6 قابل ملاحظه است.
فاصله تکاملی 30 جنس و گونه منتخب پروتئین RecA در مقایسه با ژن16SrRNA تغییرات زیادی را نشان می‌دهد. این مسئله بیانگر آن است که میزان تغییراتی که در پروتئین RecA و به طبع ژن مربوط به این پروتئین در طول تکامل در این 30 گونه انتخابی رخ داده است، با تغییرات در ژن 16SrRNA نظیر برای هر کدام از جنس و گونه‌ها مطابقت ندارد و مقدار متفاوتی را نشان می‌دهد که میزان این تغییرات در جدول 1 و شکل 6 مشخص شده است.
آنالیز توالی‌های RecA برای تعیین فاصله تکاملی
هدف اصلی این پژوهش به‌دست‌آوردن فاصله تکاملی توالی‌های منتخب RecA از خانواده پروتئینی RecA در مقایسه با توالی‌های ژن 16srRNA همان جنس و گونه‌ها بوده است. به این منظور جایگاه فایلوم‌های پروتئینی RecA را با فایلوم‌های ژن 16srRNA در درخت 16S-تاکسونومی یکسان قرار داده شد. سپس توالی‌های آمینواسیدی هر فایلوم با توالی فایلوم سرگروه (Bacteroides) همترازسازی و مقدار AAS برای هر فایلوم محاسبه شد. نتایح حاصل از این محاسبات برای خانواده RecA در شکل 6 قابل ملاحظه است.
فاصله تکاملی 30 جنس و گونه منتخب پروتئین RecA در مقایسه با ژن16SrRNA تغییرات زیادی را نشان می‌دهد. این مسئله بیانگر آن است که میزان تغییراتی که در پروتئین RecA و به طبع ژن مربوط به این پروتئین در طول تکامل در این 30 گونه انتخابی رخ داده است، با تغییرات در ژن 16SrRNA نظیر برای هر کدام از جنس و گونه‌ها مطابقت ندارد و مقدار متفاوتی را نشان می‌دهد که میزان این تغییرات در جدول 1 و شکل 6 مشخص شده است.
شکل 4. میانگین امتیاز همترازی توالی‌های 16srRNA هر فایلوم با توالی سر گروه درخت 16S-تاکسونومی
شکل 5. میانگین همترازی توالی‌های RecA هر فایلوم با توالی فایلوم سرگروه
همان‌طور که در شکل 6 قابل ملاحظه است، فایلوم Actinobacteria در درخت 16S-تاکسونومی نزدیک‌ترین فایلوم به فایلوم سرگروه است، اما در درخت RecA دورترین فایلوم است. این مسئله نشان می‌دهد ژن RecA در فایلوم Actinobacteria در مقایسه با ژن 16SrRNA تغییرات بسیار بیشتری در طول تکامل خود داشته است. در حالی که در باقی فایلوم‌هایی که در شکل دیده می‌شوند، میزان تغییرات در طول دوره تکاملی با فایلوم آکتینوباکتریوم متفاوت است. بنابراین می‌توان گفت که تغییرات RecA در فایلوم‌های مختلف سرعت‌های متنوعی داشته است و این سرعت‌های متنوع در بیشتر موارد به طور کلی تفاوت‌های اساسی با الگوی تغییرات در ژن‌های 16SrRNA نظیر دارد. فایلوم بعدی که دستخوش بیشترین تغییرات شده است، فایلوم Proteobacteria است. فایلوم سیانوباکتر Cyanobacteria در هر دو درخت جایگاه ثابت دارد. فایلوم‌های Deniococcus و Tenericutes هر دو به اندازه یک فایلوم در درخت RecA نسبت به درخت16S -تاکسونومی از سرگروه فاصله گرفتند.
جدول 1. مقدار AAS محاسبه‌شده برای فایلوم‌های ژن 16SrRNA و پروتئین RecA
| اسامی فایلوم‌ها | مقدارAAS برای فایلوم‌های 16SrRNA | مقدار AAS برای فایلوم‌های RecA |
| Actinobacteria | 952 | 870 |
| Firmicutes | 949 | 1047 |
| Cyanobacteria | 874 | 949 |
| Deinococcus | 874 | 940 |
| Tenericutes | 872 | 924 |
| Proteobacteria | 871 | 991 |
| Thermotogae | 838 | 941 |
شکل 6. نامعادله تعیین‌شده بر اساس نزدیکی فایلوم‌های 16srRNA و خانواده پروتئینی RecA به فایلوم سرگروه
بحث و نتیجه‌گیری
مقایسه نتایج فیلوژنتیک برای جانداران خاص با استفاده از ژن‌های مختلف می‌تواند تعیین کند کدام ژن‌ها برای مطالعات تکاملی مفید هستند؛ همچنین اینکه آیا تاریخچه ژن‌های متنوع با یکدیگر متفاوت است. با این حال، برای مقایسه‌های مستقیم مهم است که متغیرهای زیادی را در مطالعات ژن‌های مختلف حذف کنیم (20). بسیاری از محققان برای مطالعه سیستماتیک باکتریایی، درخت فیلوژنتیک یک ژن خاص را با درخت استاندارد یک ژن rRNA مقایسه می‌کنند (21). در دهه گذشته، توالی‌های ژن 16SrRNA برای مشخص‌کردن تفاوت‌های درون و بین گونه‌ای در بعضی از خانواده‌های باکتریایی کاربرد داشت (22). در سال‌های اخیر به منظور دسته‌بندی جدید گونه‌های مایکوباکتریوم از شباهت توالی‌های نوکلوتیدی 16SrRNA استفاده کردند. برای این منظور توالی‌های 16SrRNA از گونه‌های مختلف مایکوباکتریوم را همترازسازی کردند که نتیجه حاصل نشان‌دهنده میزان شباهت 85 الی 95 درصدی بین توالیها بود. به همین علت برای تفسیر دقیق‌تر به بررسی توالیها در سطح درون‌گونه‌ای و بین‌گونه‌ای پرداختند. پس از انجام همترازسازی دوگانه توالی‌های 16SrRNA در سطح بین‌گونه‌ای، متوجه شباهت 95 الی 98 درصدی در خانواده مایکوباکتریوم شدند. همچنین میزان شباهت برای توالی‌های 16SrRNA درون‌گونه‌ای 98 درصد به بالا بود (11).
در این پژوهش نیز ما به بررسی روند تکاملی خانواده پروتئینی RecA در مقایسه با توالی‌های 16SrRNA نظیر پرداختیم. پس از استخراج درخت 16SrRNA از پایگاه داده NCBI بررسی توالیها در سطح درون‌فایلومی و بین‌فایلومی صورت گرفت. نتیجه‌ای که از همترازسازی دوگانه حاصل شد این است که توالی‌های 16SrRNA درون یک فایلوم شباهت‌های بسیاری با یکدیگر دارند و این شباهت بین 77 تا 98 درصد است. همچنین با مقایسه صورت‌گرفته (همترازسازی دوگانه) بین نماینده‌های انتخابی هر فایلوم با فایلوم‌های دیگر شاهد کاهش میزان شباهت بین فایلومی هستیم (میزان شباهت بین 69 تا 81 درصد است).
در دیگر مطالعات انجام شده برای بررسی توالی‌های 16SrRNA در مقایسه با ژن RecA، تمام توالی‌های موجود حتی توالی‌های ناقص استخراج‌شده از پایگاه داده را بررسی کردند (23)، اما در پژوهش ما از توالی‌های کامل و گونه‌های یکسان از16SrRNA و خانواده پروتئینی RecA استفاده شد تا نتایج کامل‌تری ارائه شود. همچنین در تحقیقات دیگر از الگوریتم‌های شناخته‌شده برای ترسیم درخت فیلوژنی استفاده شده است، ولی در این پژوهش برای رسم درخت تکاملی با انجام بیش از 200 همترازسازی برای 30 توالی و همچنین با کمک درخت خام تاکسونومی استخراج‌شده از NCBI، توانسته‌ایم روشی جدید را برای رسم درخت فیلوژنی برای تعداد توالی‌های محدود ارائه کنیم (24).
بعد از بررسی‌های لازم و اهمیت جایگاه فایلوم‌ها در این پژوهش، درخت تاکسونومی از پایگاه داده NCBI بخش تاکسونومی، استخراج شد و با همترازسازی‌هایی که در قسمت‌های قبل توضیح داده شد، جایگاه فایلوم‌ها مشخص شد. سپس به مقایسه و بررسی جایگاه فایلوم‌ها در درخت RecA تاکسونومی پرداخته شد و با درخت رفرنس 16S-تاکسونومی مقایسه شد. تفاوت عمده این پژوهش با کار‌های مشابه در نحوه استخراج درخت فیلوژنی و بررسی روند تکاملی خانواده پروتئینی RecA در مقایسه با ژن ریبوزومی بود که بعضی از فایلوم‌ها طی روند تکاملی تغییرات بسیار زیادی را داشتند.
جایگاه فایلوم سیانوباکتریا در درخت 16S-تاکسونومی و RecA ثابت است که نشان‌دهنده ثبات ژنی و کمترین جهش طی تکامل است. همچنین بیشترین تغییر مربوط به فایلوم آکتینوباکتریا است. تعیین بیشترین و کمترین میزان تغییرات گونه‌های استفاده‌شده در این پژوهش طی روند تکاملی برای بررسی مقاومت‌های دارویی نیز حائز اهمیت است. به این صورت که هر چقدر نرخ تغییرات طی تکامل برای گونه‌ای بیشتر باشد، دارو‌های موجود برای از بین بردن این گونه باکتریایی ممکن است طی مدت طولانی کارآمد نباشد.
با توجه به اهمیت روند تکاملی و تغییرات باکتری‌ها و ژن‌های آنها که باعث ایجاد مقاومت دارویی می‌شوند، در این پژوهش برای بررسی تغییرات فایلوم‌های باکتریایی پروتئین RecA در مقایسه با ژن حفظشده 16SrRNA، درخت تاکسومی نوینی برای جنس و گونه‌های منتخب ژن 16SrRNA و خانواده پروتئینی RecA ارائه شده است که با الگوریتم‌های موجود بیوانفورماتیکی متفاوت است. درنهایت می‌توان شاهد تغییرات چشمگیر فایلوم Actinobacteria بود. جنس و گونه‌هایی که در این فایلوم قرار دارند اهمیت زیادی برای بررسی مقاومت دارویی باکتریایی به دلیل تغییرات و جهش‌های عمده دارند. یکی از جنس‌ها و گونه‌های شناخته‌شده در این فایلوم Mycobacterium Tuberculosis است. از جهتی دیگر می‌توان به فایلوم Cyanobacteria اشاره کرد که کمترین میزان تغییرات را دارد. درنتیجه احتمال ایجاد مقاومت دارویی مربوط به پروتئین RecA در جنس و گونه‌های این فایلوم کمتر از دیگر فایلوم‌های موجود در این پژوهش است. نتایج به‌دست‌آمده در این پژوهش ممکن است به گونه‌ای دیگر هم تفسیر شود. بنابراین می‌خواهیم به استنباط خود از این نتایج به صورت یک فرضیه اشاره کنیم. البته بررسی‌های بیشتر در کارهایی برای مطالعات آینده می‌تواند به شفاف‌سازی بیشتر این استنباط کمک کند.
سپاسگزاری
نویسندگان از تمامی کسانی که آنها را در انجام این پژوهش یاری کردند، تشکر و قدردانی می‌کنند.
تعارض منافع
بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشی |
موضوع مقاله:
بیوانفورماتیک میکروبی
دریافت: 1397/8/14 | پذیرش: 1398/2/25 | انتشار الکترونیک: 1398/4/31
دریافت: 1397/8/14 | پذیرش: 1398/2/25 | انتشار الکترونیک: 1398/4/31
فهرست منابع
1. Taghizadeh M, Khoei S, Nikoofar AR, Ghamsari L, Goliaei B. The role of Rad51 protein in radioresistance of spheroid model of DU145 prostate carcinoma cell line. International Journal of Radiation Research. 2009 Jul 1;7(1):19
2. Chintapalli SV, Bhardwaj G, Babu J, Hadjiyianni L, Hong Y, Todd GK, Boosalis CA, Zhang Z, Zhou X, Ma H, Anishkin A. Reevaluation of the evolutionary events within recA/RAD51 phylogeny. BMC genomics. 2013 Dec;14(1):240. [DOI:10.1186/1471-2164-14-240] [PMID] [PMCID]
3. Wang, Ting‐Fang, Li‐Tzu Chen, and Andrew H‐J. Wang. "Right or left turn? RecA family protein filaments promote homologous recombination through clockwise axial rotation." Bioessays 30.1 (2008): 48-56. [DOI:10.1002/bies.20694] [PMID]
4. Shinohara A, Ogawa H, Ogawa T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell. 1992 May 1;69(3):457-70. [DOI:10.1016/0092-8674(92)90447-K]
5. Bishop DK, Park D, Xu L, Kleckner N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell. 1992 May 1;69(3):439-56. [DOI:10.1016/0092-8674(92)90446-J]
6. Brendel, Volker, et al. "Evolutionary comparisons of RecA-like proteins across all major kingdoms of living organisms." Journal of molecular evolution 44.5 (1997): 528-541. [DOI:10.1007/PL00006177] [PMID]
7. Hug LA, Baker BJ, Anantharaman K, Brown CT, Probst AJ, Castelle CJ, Butterfield CN, Hernsdorf AW, Amano Y, Ise K, Suzuki Y. A new view of the tree of life. Nature microbiology. 2016 May;1(5):16048. [DOI:10.1038/nmicrobiol.2016.48] [PMID]
8. Gevers D, Cohan FM, Lawrence JG, Spratt BG, Coenye T, Feil EJ, Stackebrandt E, Van de Peer Y, Vandamme P, Thompson FL, Swings J. Re-evaluating prokaryotic species. Nature Reviews Microbiology. 2005 Sep;3(9):733. [DOI:10.1038/nrmicro1236] [PMID]
9. Godfray HC. Challenges for taxonomy. Nature. 2002 May 2;417(6884):17. [DOI:10.1038/417017a] [PMID]
10. Quast C, Pruesse E, Yilmaz P, Gerken J, Schweer T, Yarza P, Peplies J, Glöckner FO. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic acids research. 2012 Nov 27;41(D1):D590-6. [DOI:10.1093/nar/gks1219] [PMID] [PMCID]
11. Yarza P, Yilmaz P, Pruesse E, Glöckner FO, Ludwig W, Schleifer KH, Whitman WB, Euzéby J, Amann R, Rosselló-Móra R. Uniting the classification of cultured and uncultured bacteria and archaea using t rRNA gene sequences. Nature Reviews Microbiology. 2014 Sep;12(9):635. [DOI:10.1038/nrmicro3330] [PMID]
12. Beye M, Fahsi N, Raoult D, Fournier PE. Careful use of 16S rRNA gene sequence similarity values for the identification of Mycobacterium species. New microbes and new infections. 2018 Mar 1;22:24-9. [DOI:10.1016/j.nmni.2017.12.009] [PMID] [PMCID]
13. Edgar RC. MUSCLE: a multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity. BMC bioinformatics. 2004 Dec;5(1):113.
14. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Molecular biology and evolution. 2011 Oct 1;28(10):2731-9. [DOI:10.1093/molbev/msr121] [PMID] [PMCID]
15. Eisen JA. The RecA protein as a model molecule for molecular systematic studies of bacteria: comparison of trees of RecAs and 16S rRNAs from the same species. Journal of molecular evolution. 1995 Dec 1;41(6):1105-23. [DOI:10.1007/BF00173192] [PMID] [PMCID]
16. 16)Hofmann K, Bucher P, Falquet L, Bairoch A. The PROSITE database, its status in 1999. Nucleic Acids Research. 1999 Jan 1;27(1):215-9. [DOI:10.1093/nar/27.1.215] [PMID] [PMCID]
17. Li W, Godzik A. Cd-hit: a fast program for clustering and comparing large sets of protein or nucleotide sequences. Bioinformatics. 2006 May 26;22(13):1658-9. [DOI:10.1093/bioinformatics/btl158] [PMID]
18. Fu L, Niu B, Zhu Z, Wu S, Li W. CD-HIT: accelerated for clustering the next-generation sequencing data. Bioinformatics. 2012 Oct 11;28(23):3150-2. [DOI:10.1093/bioinformatics/bts565] [PMID] [PMCID]
19. Federhen S. The NCBI taxonomy database. Nucleic acids research. 2011 Dec 1;40(D1):D136-43 [DOI:10.1093/nar/gkr1178] [PMID] [PMCID]
20. Coenye T, Vandamme P. Use of the genomic signature in bacterial classification and identification. Systematic and applied microbiology. 2004 Jan 1;27(2):175-85. [DOI:10.1078/072320204322881790] [PMID]
21. Stackebrandt E, Goebel BM. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 1994 Oct 1;44(4):846-9. [DOI:10.1099/00207713-44-4-846]
22. Woo PC, Tsoi HW, Leung KW, Lum PN, Leung AS, Ma CH, Kam KM, Yuen KY. Identification of Mycobacterium neoaurumIsolated from a Neutropenic Patient with Catheter-Related Bacteremia by 16S rRNA Sequencing. Journal of clinical microbiology. 2000 Sep 1;38(9):3515-7.
23. Berson AE, Peters MR, Waleh NS. Nucleotide sequence of recA gene of Aquaspirillum magnetotacticum. Nucleic acids research. 1990 Feb 11;18(3):675. [DOI:10.1093/nar/18.3.675] [PMID] [PMCID]
24. Chintapalli SV, Bhardwaj G, Babu J, Hadjiyianni L, Hong Y, Todd GK, Boosalis CA, Zhang Z, Zhou X, Ma H, Anishkin A. Reevaluation of the evolutionary events within recA/RAD51 phylogeny. BMC genomics. 2013 Dec;14(1):240 [DOI:10.1186/1471-2164-14-240] [PMID] [PMCID]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
