سال 13، شماره 2 - ( خرداد - تیر 1398 )
جلد 13 شماره 2 صفحات 124-114 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Masoumipour F, Hassanshahian M, Sasan H, Jafarinasab T. Antimicrobial Effect of Combined Extract of Three Plants Camellia Sinensis, Teucrium Polium and Piper Nigrum on Antibiotic Resistant Pathogenic Bacteria. Iran J Med Microbiol 2019; 13 (2) :114-124
URL: http://ijmm.ir/article-1-775-fa.html
URL: http://ijmm.ir/article-1-775-fa.html
معصومی پور فاطمه، حسن شاهیان مهدی، ساسان حسینعلی، جعفری نسب طیبه. بررسی اثر ضدباکتریایی عصاره ترکیبی سه گیاه کلپوره، فلفل سیاه و چای سبز بر باکتریهای پاتوژن مقاوم به آنتی‌بیوتیک. مجله میکروب شناسی پزشکی ایران. 1398; 13 (2) :114-124
1- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران
2- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران ، hsasa@uk.ac.ir
2- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران ، hsasa@uk.ac.ir
متن کامل [PDF 1086 kb]
(2802 دریافت)
| چکیده (HTML) (5614 مشاهده)
بیماری های عفونی، بیماری های گسترده و شایع در جهان هستند که هزینه های فراوانی را به جوامع بشری تحمیل می‌کنند و تهدیدی برای سلامت بشر محسوب می‌شوند. میزان مرگ و میر ناشی از این بیماری ها روز به روز در جهان، به‌خصوص در کشورهای در حال توسعه رو به افزایش است. یکی از راه های اصلی درمان بیماری های عفونی، استفاده از آنتی بیوتیک است. امروزه با افزایش استفاده از آنتی بیوتیک های رایج درمانی، مقاومت گونه های میکروبی بیماریزا، در حال شیوع و گسترش روزافزون است (۳-۱). یکی از دلایل مقاومت باکتری ها تشکیل ساختارهای بیوفیلمی است که به معظل شدید عفونت ها تبدیل شده است. بیوفیلم، اجتماعی از سلولهای میکروبی است که با یک ماتریکس خارج سلولی شامل اگزوپلی ساکارید، پروتئین و DNA محصور شده اند و این ماتریکس نقش حفاظتی از سلول را در برابر عوامل مختلف بر عهده دارد که مانع از نفوذ ترکیبات ضدمیکروبی و عملکرد مناسب آنها میشود؛ به طوری که برخی از محققان ادعا می کنند مقاومت بیوفیلمی باکتری ها نسبت به آنتی‌بیوتیک هزاران برابر بیشتر از فرم منفرد باکتریایی است (۸-۴). در سالهای اخیر، اهمیت بیوفیلم در ایجاد بیماری ها، گسترش مقاومت های میکروبی و اثرات جانبی مصرف آنتی‌بیوتیک ها باعث شده است محققان به منظور دستیابی به ترکیبات ضدمیکروبی جدید، به‌ویژه در فرم بیوفیلم میکروب ها، از ترکیبات طبیعی مانند عصاره های گیاهی استفاده کنند. گیاهان دارویی، بهترین کاندید برای مهار باکتری های عفونتزای مقاومت به آنتی‌بیوتیک هستند که از مزایای آن می توان به کم‌بودن هزینه تولید، عوارض جانبی کم، نداشتن مشکلات زیست‌محیطی اشاره کرد (۹ ،۲).
جمع‌آوری، شناسایی و استخراج عصاره
گیاه تازه چای سبز (برگ)، فلفل سیاه (میوه) و کلپوره (گل) از حومه شهر کرمان جمع آوری و پس از شناسایی و تأیید توسط کارشناس گیاه‌شناسی بخش گیاهی دانشگاه شهید باهنر کرمان، شسته شد. سپس بخش های مورد استفاده آن به طور جداگانه روی کاغذ پهن و در دمای 35 درجه به مدت سه روز خشک شدند. نمونه‌های خشک‌شده با استفاده از هاون و مخلوط‌کن برقی پودر شدند. به منظور عصاره گیری از روش ماسراسیون تغییریافته استفاده شد که طی آن پودر هر گیاه به ترتیب با حلال های آلی متانولی (۹۶ درصد) و اتانولی (۸۰ درصد) با نسبت جرمی-حجمی ۱:۱۰ مخلوط شد و در دمای ۴۰ درجه به مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت در انکوباتور شیکردار مرتب هم زده شد. برای حذف قطعات درشت گیاهی از کاغذ واتمن شماره ۱ استفاده و محلول حاصل برای حذف حلال اضافی به دستگاه روتاری منتقل شد. سپس محلول در انکوباتور ۴۰ درجه به مدت ۴۸ تا ۷۲ ساعت قرار گرفت تا پودر خشکی از عصاره به دست آید که این پودر تا زمان استفاده در ظرفهای شیشه‌ای تیره و در دمای ۴- درجه نگهداری شد (۲۵).
میکروارگانیسمهای مطالعه‌شده و محیط کشت
در این پژوهش ۲ باکتری گرم مثبت (Staphylococcus aureus ATCC 1189 و Bacillus cereus ATCC 1298) و ۳ باکتری گرم منفی (Escherichia coli ATCC 35218، Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853، Acinetobacter baumannii ATCC 1611، Klebsiella pneumonia ATCC 700603 ) از آزمایشگاه میکروب‌شناسی دانشگاه علوم پزشکی کرمان تهیه شد. میکروارگانیسم ها در دمای ۸۰- درجه سلسیوس در محیط نوترینت براث در گلیسرول ۲۰ درصد نگهداری شدند. از محیط کشت مولر هینتون آگار برای انتشار در دیسک، MIC و MBC استفاده شد.
بررسی اثر ضدمیکروبی عصاره گیاهی به روش انتشار دیسک
فعالیت ضدمیکروبی عصاره خام با استفاده از روش انتشار دیسک بوئر کربی بررسی شد. به طور خلاصه بعد از کشت یک شبه باکتری ها تا رسیدن به کدورت cfu/mL 108× 1/5 رقیق شد. دیسکهای بلانک 6 میلیمتری درون محلول عصاره با غلظت mg/mL ۱۰۰ به مدت یک ساعت غوطه‌ور شدند. سپس به کمک پنس استریل دیسک های حاوی عصاره (mg/mL ۱۰۰) درون یک پلیت استریل قرار گرفتند تا در دمای محیط خشک شوند. نحوه سنجش میزان عصاره موجود در هر دیسک نیز بدین صورت بود که مقدار 100 میلی‌گرم از عصاره خشک‌شده در یک سی‌سی متانول یا اتانول حل شد و سپس دیسکها در این محلول به مدت یک ساعت فرو برده شدند. وزن دیسکها قبل از فرو بردن در محلول یادداشت شد. سپس دیسکها از محلول بیرون آورده و در دمای اتاق خشک و دوباره وزن شدند. میزان جذب عصاره بر اساس اختلاف وزن و گراویمتری محاسبه شد. در نهایت دیسک های تهیه‌شده با فاصله منظم روی محیط قرار گرفت و پلیت های حاوی باکتری به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه انکوبه شدند. دیسک حاوی اتانول و متانول به عنوان کنترل در نظر گرفته شد. قطر هاله عدم رشد دیسکها به کمک خط‌کش میلیمتری اندازه‌گیری شد (۲۶).
تعیین حداقل غلظت مهاری و حداقل غلظت کشندگی عصاره
مقادیر MIC و MBC عصاره ترکیبی T.C.P با روش ماکروبراث دایلوشن و طبق برنامه European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) انجام شد. در این روش ۱۰ رقت از محلول عصاره اتانولی و متانولی با روش رقیق‌سازی متوالی تهیه و برای تعیین Minimum Inhibitory Concentration (MIC) و Minimum Bactericidal Concentration (MBC) به کار رفت. سپس ۱ میلیلیتر سوسپانسیون باکتری ۲۴ ساعته به کدورت ۱۰۵×۵ در محیط کشت نوترینت براث به هر رقت (1 میلیلیتر) اضافه شد و به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سلسیوس انکوبه شدند. باکتری به همراه محیط کشت نوترینت براث به عنوان کنترل در نظر گرفته شد. لولهها با کدورت کنترل مقایسه و کمترین غلظتی که رشد باکتری مهارشده داشت، به عنوان MIC در نظر گرفته شد. برای تعین MBC هر یک از عصارهها بدین صورت عمل شد که رقت‌هایی از MIC که هیچ کدورت قابل مشاهده‌ای نداشتند انتخاب شدند. میزان 100 میکرولیتر از این رقت‌ها روی محیط نوترینت آگار به روش سفره‌ای کشت داده و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شد. در نهایت کمترین غلظتی که باکتری پس از انکوباسیون ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سلسیوس رشد نکرد، به عنوان MBC تعیین شد (۲۷).
قابلیت تشکیل بیوفیلم به وسیله سویه‌ها
قابلیت تشکیل بیوفیلم به وسیله سویه‌ها با روش O'Toole and Kolter بررسی شد.
قابلیت عصاره در ممانعت از تشکیل بیوفیلم
تشکیل بیوفیلم توسط O'Toole و Kolter (۲۸) با اندکی تغییرات بررسی شد. ابتدا سه رقت mg/mL ۲۵-6/25 از عصاره اتانولی و متانولی تهیه و ۱۰۰ میکرولیتر آن به چاهک میکروپلیت ۹۶ خانه ای اضافه شد. سپس ۱۰۰ میکرولیتر از سوسپانسیون باکتریایی به چاهک اضافه شد و پلیت ها برای ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سلسیوس انکوبه شدند. چاهک حاوی TSB و آب استریل به عنوان کنترل در نظر گرفته شد. پس از انکوباسیون میکروتیتر پلیت ۳ مرتبه با بافر فسفات سالین(Phosphate-Buffered Saline (PBS)) شسته شد. سپس ۱۵۰ میکرولیتر متانول ۹۶ درصد برای تثبیت سلول های چسبیده اضافه شد و بعد از حذف متانول، ۲۰۰ میکرولیتر کریستال ویوله ۱ درصد به چاهک اضافه و برای 5 دقیقه در دمای ۳۰ درجه انکوبه شد. در آخر ۱۶۰ میکرولیتر اسید استیک گلاسیال ۳۳ درصد به چاهک اضافه و جذب نوری با دستگاه الایزا ریدر (India , Biotec, ELX-800) در طول موج ۶۳۰ نانومتر خوانده شد.
M: درصد مهار تشکیل بیوفیلم،A : میانگین جذب نوری کنترل،B : میانگین جذب نوری کنترل محیط کشت،C : میانگین جذب نوری چاهک آزمون،D : میانگین جذب نوری کنترل عصاره (۲۹).
قابلیت عصاره در تخریب ساختارهای بیوفیلمی تشکیل‌شده
برای تشکیل بیوفیلم ها، 100 میکرولیتر از کشتهای باکتریایی در محیط TSB در چاهکهای میکروپلیت ۹۶ خانه ای به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس انکوباتور شدند. پس از تشکیل بیوفیلم، محیط به‌آرامی خالی شد و سلول های غیرچسبنده با شستن بیوفیلم ها توسط PBS (۲ مرتبه) استریل حذف شدند. برای بررسی اثر عصاره بر روی بیوفیلم از قبل تشکیل شده، هر عصاره به غلظت های مختلف (mg/mL ۲۵-6/25) به چاهک ها اضافه و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس انکوبه شد. مهار بیوفیلم تشکیل‌شده با رنگ‌آمیزی بنفش کریستالی تجزیه و تحلیل شد. درصد کاهش ساختارهای بیوفیلم در حضور غلظت های مختلف عصاره ها با استفاده از فرمول M=100×{(A-B)-(C-D) / (A-B)} محاسبه شد (۳۰).
قابلیت عصاره بر فعالیت آنزیم دهیدروژناز
Hoiby و همکاران (2010) تأثیر عصاره بر فعالیت متابولیک بیوفیلم تشکیل‌شده را با اندکی تغییرات گزارش کرده‌اند. به طور خلاصه، بیوفیلم های ساخته‌شده از قبل ابتدا 2 مرتبه با PBS شسته شدند، سپس عصاره با غلظتهای مختلف (mg/mL ۲۵-6/25) اضافه شد و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس انکوباتور شدند. بعد از انکوباسیون،50 میکرولیتر از محلول تری فنیل تترازولیوم کلراید(Triphenyl Tetrazolium Chloride (TTC) ) به هر چاهک اضافه شد و به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس انکوبه شدند. سپس جذب نهایی در 490 نانومتر با استفاده دستگاه الایزا ریدر (India , Biotec, ELX-800) در طول موج۶۳۰ نانومتر خوانده شد. درصد کاهش فعالیت متابولیک بیوفیلم در حضور غلظت های مختلف عصارهها با استفاده از فرمول
M=100×{(A-B)-(C-D) / (A-B)} محاسبه شد (۳۱).
تحلیل آماری یافته‌ها
تمام آزمون ها با سه بار تکرار انجام شد و اختلاف میان داده‌ها با استفاده از تحلیل واریانس (ANOVA) و SPSS نسخه 18 برای ویندوز و در سطح معنی‌داری 0/05 بررسی شد.
اثراث مهاری عصاره ترکیبی در برابر فرم منفرد باکتریهای
میانگین قطر هاله مهاری، مقادیر MIC و MBC عصاره ترکیبی T.C.P در جدول ۱ آورده شده است. بر اساس مشاهدات انجام‌شده باکتری سودوموناس ائروزینوزا بیشترین حساسیت (1/12±۲۱) و باکتری کلبسیلا پنومونیهکمترین حساسیت (0/89±۸) را به عصاره متانولی نشان داد. مقادیر MIC و MBC برای ترکیب T.C.P بر باکتریهای مطالعه‌شده در محدوده غلظتیmg/mL 50-25 به دست آمد. MIC برای عصاره متانولی بر باسیلوس سرئوس و سودوموناس ائروزینوزا و برای عصاره اتانولی باکتریهای استافیلوکوکوس اورئوس و اشریشیا کلی مشاهده نشد. MBC برای عصاره اتانولی باکتری سودوموناس ائروزینوزا و کلبسیلا پنومونیه و عصاره متانولی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس و اسینتوباکتر بومانی دیده نشد.
شکل ۳. مقایسه تأثیر عصاره اتانولی ترکیب T.C.P بر آنزیم دهیدروژناز باکتریها
شکل ۴. مقایسه تأثیر عصاره متانولی ترکیب T.C.P بر آنزیم دهیدروژناز باکتریها
امروزه یکی از دلایل اصلی ایجاد عفونت در انسان، مقاومت آنتی‌بیوتیکی باکتری ها به علت مصرف آنتی‌بیوتیک است که موجب ظهور و گسترش سویه های باکتری مقاوم به آنتی‌بیوتیک می شود. بیش از ۸۰ درصد از باکتری های عفونت‌زا در انسان، ساختارهای بیوفیلمی تشکیل می دهند. بنابراین تلاش‌های فراوانی برای دستیابی به اطلاعات بیشتر در مورد مواد مؤثره موجود در گیاهان و کاربرد آنها در درمان عفونت های مختلف و کنترل بیوفیلم در حال انجام است (۳۴-۳۲). استفاده از مواد ضدمیکروبی با پایه گیاهی می‌تواند در کنترل تشکیل بیوفیلم و بیماریهای عفونی نقش باارزشی ایفا کن؛ به طوری که ۸۰ درصد از مردم کشورهای توسعه‌یافته از گیاهان دارویی برای درمان بیماری های مختلف استفاده می کنند (۳۵).
اگرچه فعالیت ضدباکتریایی و ضدقارچی زیادی از عصاره های گیاهی گزارش شده است، ولی اثربخشی آنها در برابر باکتری های مقاوم به آنتی‌بیوتیک بسیار کم است. در همین راستا، در این مطالعه خواص ضدباکتریایی عصاره ترکیبی T.C.P بر شش گونه باکتری مقاوم به آنتی‌بیوتیک بررسی شد. نتایج مطالعه حاضر در آزمون انتشار دیسک، MICو MBC نشان می دهد عصاره ترکیبی T.C.P توانایی زیادی در جلوگیری از رشد باکتری های مقاوم به آنتی‌بیوتیک دارد؛ به طوری که بیشترین قطر هاله عدم رشد عصاره اتانولی و متانولی ترکیب T.C.P مربوطه به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (mm 0/77±۲۰) و سودوموناس ائروزینوزا (mm 1/12±۲۱) بود. همچنین مقادیر MIC و MBC برای عصاره ترکیبی T.C.P بر باکتریهای مطالعه‌شده در محدوده غلظتی mg/mL 50-۲۵ به دست آمد که بیشترین غلظت مهارکنندگی عصاره اتانولی و متانولی به ترتیب مربوطه به باکتری سودوموناس ائروزینوزا mg/mL) 0/28±۵۰) و استافیلوکوکوس اورئوس (mg/mL 1/23±۵۰) به دست آمد.
در مطالعات Cui و همکارانش در سال ۲۰۱۲، Radji و همکارانش در سال ۲۰۱۳ و Liaqat و همکارانش در سال ۲۰۱۶، نتایج مشابهی اثر مهارکنندگی عصاره چای سبز بر باکتری های استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA))،
سودوموناس ائروزینوزا مقاوم به چند دارو (Multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa (MDR-P. aeruginosa))،، استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سرئوس، سودوموناس ائروزینوزا، اشریشیا کلی و کلبسیلا پنومونیه را تأیید میکند که این خاصیت را به طور کلی به ترکیبات پلی فنول درون عصاره چای سبز در برابر باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی مرتبط دانستند (38-36). همچنین مطالعات Darabpour و همکارانش در سال ۲۰۱۰ و Hatano و همکارانش در سال ۲۰۰۵ اثر مهاری عصاره کلپوره بر باکتری استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین و باکتریهای باسیلوس سرئوس، استافیلوکوکوس اورئوس و اشریشیا کلی را تأیید می کنند (40 ،39). Karsha و همکارانش در سال ۲۰۱۰ و Sabaghi و همکارانش در سال ۲۰۱۴ اثر بازدارندگی عصاره فلفل سیاه در برابر باکتریهای استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به آنتی‌بیوتیک، استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سرئوس، سودوموناس ائروزینوزا، اشریشیا کلی و کلبسیلا پنومونیه را نشان دادند. در مطالعات آنها این عصاره در غلظتهای۱۰، 1/25، 2/50، 6/25، 1/25 و 1/25 mg/mL بیشترین اثر بازدارندگی را داشت (41،42).
تفاوت میان اثربخشی عصاره در آزمون انتشار دیسک، MIC و MBC احتمالا به علت تفاوت در انتشار عصاره از دیسکهای حاوی آن و انتشار در محیط مایع آزمون است. به طور کلی حلال اتانولی به طور مؤثرتری نسبت به حلال متانولی توانسته است با اجزا و مواد تشکیل‌دهنده عصاره ترکیبی T.C.P واکنش ایجاد کند و باعث افزایش خروج مواد مؤثر از گیاه و بالا رفتن غلظت این مواد در عصاره اتانولی نسبت به عصاره متانولی T.C.P شود. اثرات ضدباکتریایی این عصاره ترکیبی ممکن است به خاطر ترکیبات موجود در عصاره باشد که میکروارگانیسم‌ها هرگز در معرض آن قرار نگرفته‌اند. بنابراین هرگز فرصتی برای ایجاد مقاومت نداشته‌اند. همچنین ترکیبات شناخته‌شده درون عصاره این سه گیاه دارویی شامل پلی‌فنل ها، تانن ها، آلفا و بتا پینن ها و غیره می تواند باعث رسوب پروتئین های باکتری، مهار فعالیت آنزیمی، تخریب غشا و در نتیجه مرگ میکروارگانیسم شود (47-43).
گیاهان نقش مهمی در از بین‌بردن شکل‌گیری بیوفیلم باکتری های بیماریزا دارند. ترکیبات عصاره آنها مانع از شکل‌گیری و توسعه بیوفیلم می شود. در مطالعه حاضر عصاره ترکیبی T.C.P در مقابله با ساختار بیوفیلم کارآمد بود. اثر بازدارنده عصاره به طور مستقیم با غلظت ارتباط دارد. توانایی عصاره اتانولی در مهار بیوفیلم بیشتر از تخریب بیوفیلم یا جلوگیری از فعالیت متابولیک سلول میکروبی در ساختار بیوفیلم بود که می توان نتیجه گرفت عصاره اتانولی حاوی مولکولی است که با تشکیل بیوفیلم باکتری در ارتباط است، اما این عصاره توانایی کمی برای مقابله با ساختار بیوفیلم دارد. تفاوت بین نتایج مشاهدات ما احتمالا به دلیل مواد شیمیایی متنوع آنها در گونه های مختلف گیاهی به‌ویژه در روش استخراج آنهاست. در مطالعات Agrawal در سال ۲۰۱۱ و Gibbons در سال ۲۰۰۴ نشان داده شد عصاره چای سبز باعث مهار تشکیل بیوفیلم در باکتری های اشریشیا کلی، استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس ائروزینوزا میشود که مطابق با تحقیقات انجام‌شده است (49،48). همچنین گزارش شده است که عصاره این گیاهان با اثرگذاری روی چسبندگی و سیستم کوئروم سنسینگ باکتری ها مانع از شکل‌گیری بیوفیلم میشود (۵۰).
براساس نتایج حاصل از این پژوهش، می توان نتیجه گرفت عصاره ترکیبی T.C.P در شرایط آزمایشگاهی قابلیت مهار ۶ باکتری مقاوم به آنتی‌بیوتیک را دارد . بر این اساس می توان از این عصاره برای بهبود عملکرد آنتی‌بیوتیک‌ها یا حتی جایگزین آنها استفاده کرد.
نویسندگان این مقاله از معاونت پژوهشی دانشگاه شهید باهنر کرمان به خاطر حمایت مالی صمیمانه سپاسگزاری می‌کنند.
بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.
متن کامل: (11367 مشاهده)
مقدمه
بیماری های عفونی، بیماری های گسترده و شایع در جهان هستند که هزینه های فراوانی را به جوامع بشری تحمیل می‌کنند و تهدیدی برای سلامت بشر محسوب می‌شوند. میزان مرگ و میر ناشی از این بیماری ها روز به روز در جهان، به‌خصوص در کشورهای در حال توسعه رو به افزایش است. یکی از راه های اصلی درمان بیماری های عفونی، استفاده از آنتی بیوتیک است. امروزه با افزایش استفاده از آنتی بیوتیک های رایج درمانی، مقاومت گونه های میکروبی بیماریزا، در حال شیوع و گسترش روزافزون است (۳-۱). یکی از دلایل مقاومت باکتری ها تشکیل ساختارهای بیوفیلمی است که به معظل شدید عفونت ها تبدیل شده است. بیوفیلم، اجتماعی از سلولهای میکروبی است که با یک ماتریکس خارج سلولی شامل اگزوپلی ساکارید، پروتئین و DNA محصور شده اند و این ماتریکس نقش حفاظتی از سلول را در برابر عوامل مختلف بر عهده دارد که مانع از نفوذ ترکیبات ضدمیکروبی و عملکرد مناسب آنها میشود؛ به طوری که برخی از محققان ادعا می کنند مقاومت بیوفیلمی باکتری ها نسبت به آنتی‌بیوتیک هزاران برابر بیشتر از فرم منفرد باکتریایی است (۸-۴). در سالهای اخیر، اهمیت بیوفیلم در ایجاد بیماری ها، گسترش مقاومت های میکروبی و اثرات جانبی مصرف آنتی‌بیوتیک ها باعث شده است محققان به منظور دستیابی به ترکیبات ضدمیکروبی جدید، به‌ویژه در فرم بیوفیلم میکروب ها، از ترکیبات طبیعی مانند عصاره های گیاهی استفاده کنند. گیاهان دارویی، بهترین کاندید برای مهار باکتری های عفونتزای مقاومت به آنتی‌بیوتیک هستند که از مزایای آن می توان به کم‌بودن هزینه تولید، عوارض جانبی کم، نداشتن مشکلات زیست‌محیطی اشاره کرد (۹ ،۲).
گیاهان دارویی با داشتن متابولیت های ثانویه فراوان، مواد مؤثر اولیه بسیاری از داروها را دارند. در نتیجه این گیاهان میتوانند به عنوان یکی از مهمترین منابع دارویی با اثرات ضدباکتریایی و ضدقارچی جدید شمرده شوند (۱۲-۱۰). این گیاهان از طریق تحریک سیستم ایمنی، فعالیت ضد التهابی و ضد اکسیدانی، افزایش هضم و جذب مواد غذایی و فعالیت های ضدباکتریایی، ضدقارچی و ضدانگلی در درمان بسیاری از بیماری ها به کار می روند (14 ،13). ایران به علت آب و هوای متنوع و وسعت زیاد تنوع زیادی از گیاهان دارویی را دارد که اساس و پایه طب سنتی کشور را تشکیل میدهد.
در این پژوهش اثر ضدمیکروبی سه گیاه دارویی شامل کلپوره، چای سبز و فلفل سیاه بررسی شد (۱۵). کلپوره با نام علمی Teucrium polium متعلق به تیره Lamiaceae، گیاهی علفی با ظاهری سفید و پنبه‌ای است. از این گیاه به عنوان ضدباکتری، ضدالتهاب، کاهش قند و چربی خون استفاده میشود. این گیاه حاوی ترکیبات زیادی از جمله تانن، ترپنوئید، ساپونین، استرول، فلاونویید و لوکوآنتوسیانین است که می توان از عصاره این گیاه در درمان بسیاری از بیماری ها بهره برد (۱۸-۱۶). بیشتر ترکیبات مؤثر این گیاه در حلال‌های قطبی مثل الکل‌ها قابلیت انحلال دارند.
چای سبز با نام علمی Camellia sinensis متعلق به تیره Theaceae، از رایجترین گیاهان دارویی پرمصرف در جهان است که در محصولات آرایشی، دارویی و غذایی کاربرد دارد (۱۹). از مهمترین ترکیبات موجود در این گیاه میتوان به فلاونوئیدها به‌ویژه کاتچین ها اشاره کرد که اثرات مفیدی از جمله کاهش خطرات بیماریهای قلبی و عروقی، کاهش بروز بعضی از سرطانها، کاهش فشار خون، کنترل وزن بدن، خاصیت پری‌بیوتیکی، آنتی‌اکسیدانی، ضدمیکروبی و ضدویروسی، محافظت در برابر نور خورشید، افزایش تراکم استخوان و تأثیر مثبت بر عملکرد سیستم عصبی دارد (۲۲-۲۰).
فلفل سیاه با نام علمی Piper nigrum متعلق به تیره Piperaceae، یکی از گیاهان دارویی است که در جنوب هند و سایر مناطق گرمسیری کشت میشود. این گیاه دارویی دارای ترکیباتی شامل آلفا و بتا پینن ها، لینالئول و ترپینئول است که خواص ضدعفونی‌کننده، ضدباکتریایی، تب‌بر دارد و در درمان بیماری قلبی، گرفتگی سینه، سوء هاضمه، گزش حشرات، بیخوابی، درد مفاصل، بیماری ریوی، آبله دهانی، آفتاب‌زدگی و دندان درد استفاده میشود (24 ،23). بیشتر مطالعات انجام‌شده در رابطه با عصاره های این سه گیاه دارویی، بیشتر بر فرم منفرد باکتری انجام شده است. از این رو در پژوهش حاضر فعالیت ضدباکتریایی عصاره ترکیبی (متانولی و اتانولی) سه گیاه دارویی (کلپوره، فلفل سیاه و چای سبز) در شهر کرمان علیه باکتری های مقاوم به آنتی‌بیوتیک شامل
Escherichia coli ،Pseudomonas aeruginosa ،Bacillus cereus ،Staphylococcus aureus، Acinetobacter baumannii، Klebsiella pneumonia در فرم بیوفیلم و منفرد بررسی شده است.
در این پژوهش اثر ضدمیکروبی سه گیاه دارویی شامل کلپوره، چای سبز و فلفل سیاه بررسی شد (۱۵). کلپوره با نام علمی Teucrium polium متعلق به تیره Lamiaceae، گیاهی علفی با ظاهری سفید و پنبه‌ای است. از این گیاه به عنوان ضدباکتری، ضدالتهاب، کاهش قند و چربی خون استفاده میشود. این گیاه حاوی ترکیبات زیادی از جمله تانن، ترپنوئید، ساپونین، استرول، فلاونویید و لوکوآنتوسیانین است که می توان از عصاره این گیاه در درمان بسیاری از بیماری ها بهره برد (۱۸-۱۶). بیشتر ترکیبات مؤثر این گیاه در حلال‌های قطبی مثل الکل‌ها قابلیت انحلال دارند.
چای سبز با نام علمی Camellia sinensis متعلق به تیره Theaceae، از رایجترین گیاهان دارویی پرمصرف در جهان است که در محصولات آرایشی، دارویی و غذایی کاربرد دارد (۱۹). از مهمترین ترکیبات موجود در این گیاه میتوان به فلاونوئیدها به‌ویژه کاتچین ها اشاره کرد که اثرات مفیدی از جمله کاهش خطرات بیماریهای قلبی و عروقی، کاهش بروز بعضی از سرطانها، کاهش فشار خون، کنترل وزن بدن، خاصیت پری‌بیوتیکی، آنتی‌اکسیدانی، ضدمیکروبی و ضدویروسی، محافظت در برابر نور خورشید، افزایش تراکم استخوان و تأثیر مثبت بر عملکرد سیستم عصبی دارد (۲۲-۲۰).
فلفل سیاه با نام علمی Piper nigrum متعلق به تیره Piperaceae، یکی از گیاهان دارویی است که در جنوب هند و سایر مناطق گرمسیری کشت میشود. این گیاه دارویی دارای ترکیباتی شامل آلفا و بتا پینن ها، لینالئول و ترپینئول است که خواص ضدعفونی‌کننده، ضدباکتریایی، تب‌بر دارد و در درمان بیماری قلبی، گرفتگی سینه، سوء هاضمه، گزش حشرات، بیخوابی، درد مفاصل، بیماری ریوی، آبله دهانی، آفتاب‌زدگی و دندان درد استفاده میشود (24 ،23). بیشتر مطالعات انجام‌شده در رابطه با عصاره های این سه گیاه دارویی، بیشتر بر فرم منفرد باکتری انجام شده است. از این رو در پژوهش حاضر فعالیت ضدباکتریایی عصاره ترکیبی (متانولی و اتانولی) سه گیاه دارویی (کلپوره، فلفل سیاه و چای سبز) در شهر کرمان علیه باکتری های مقاوم به آنتی‌بیوتیک شامل
Escherichia coli ،Pseudomonas aeruginosa ،Bacillus cereus ،Staphylococcus aureus، Acinetobacter baumannii، Klebsiella pneumonia در فرم بیوفیلم و منفرد بررسی شده است.
مواد و روش ها
جمع‌آوری، شناسایی و استخراج عصاره
گیاه تازه چای سبز (برگ)، فلفل سیاه (میوه) و کلپوره (گل) از حومه شهر کرمان جمع آوری و پس از شناسایی و تأیید توسط کارشناس گیاه‌شناسی بخش گیاهی دانشگاه شهید باهنر کرمان، شسته شد. سپس بخش های مورد استفاده آن به طور جداگانه روی کاغذ پهن و در دمای 35 درجه به مدت سه روز خشک شدند. نمونه‌های خشک‌شده با استفاده از هاون و مخلوط‌کن برقی پودر شدند. به منظور عصاره گیری از روش ماسراسیون تغییریافته استفاده شد که طی آن پودر هر گیاه به ترتیب با حلال های آلی متانولی (۹۶ درصد) و اتانولی (۸۰ درصد) با نسبت جرمی-حجمی ۱:۱۰ مخلوط شد و در دمای ۴۰ درجه به مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت در انکوباتور شیکردار مرتب هم زده شد. برای حذف قطعات درشت گیاهی از کاغذ واتمن شماره ۱ استفاده و محلول حاصل برای حذف حلال اضافی به دستگاه روتاری منتقل شد. سپس محلول در انکوباتور ۴۰ درجه به مدت ۴۸ تا ۷۲ ساعت قرار گرفت تا پودر خشکی از عصاره به دست آید که این پودر تا زمان استفاده در ظرفهای شیشه‌ای تیره و در دمای ۴- درجه نگهداری شد (۲۵).
میکروارگانیسمهای مطالعه‌شده و محیط کشت
در این پژوهش ۲ باکتری گرم مثبت (Staphylococcus aureus ATCC 1189 و Bacillus cereus ATCC 1298) و ۳ باکتری گرم منفی (Escherichia coli ATCC 35218، Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853، Acinetobacter baumannii ATCC 1611، Klebsiella pneumonia ATCC 700603 ) از آزمایشگاه میکروب‌شناسی دانشگاه علوم پزشکی کرمان تهیه شد. میکروارگانیسم ها در دمای ۸۰- درجه سلسیوس در محیط نوترینت براث در گلیسرول ۲۰ درصد نگهداری شدند. از محیط کشت مولر هینتون آگار برای انتشار در دیسک، MIC و MBC استفاده شد.
بررسی اثر ضدمیکروبی عصاره گیاهی به روش انتشار دیسک
فعالیت ضدمیکروبی عصاره خام با استفاده از روش انتشار دیسک بوئر کربی بررسی شد. به طور خلاصه بعد از کشت یک شبه باکتری ها تا رسیدن به کدورت cfu/mL 108× 1/5 رقیق شد. دیسکهای بلانک 6 میلیمتری درون محلول عصاره با غلظت mg/mL ۱۰۰ به مدت یک ساعت غوطه‌ور شدند. سپس به کمک پنس استریل دیسک های حاوی عصاره (mg/mL ۱۰۰) درون یک پلیت استریل قرار گرفتند تا در دمای محیط خشک شوند. نحوه سنجش میزان عصاره موجود در هر دیسک نیز بدین صورت بود که مقدار 100 میلی‌گرم از عصاره خشک‌شده در یک سی‌سی متانول یا اتانول حل شد و سپس دیسکها در این محلول به مدت یک ساعت فرو برده شدند. وزن دیسکها قبل از فرو بردن در محلول یادداشت شد. سپس دیسکها از محلول بیرون آورده و در دمای اتاق خشک و دوباره وزن شدند. میزان جذب عصاره بر اساس اختلاف وزن و گراویمتری محاسبه شد. در نهایت دیسک های تهیه‌شده با فاصله منظم روی محیط قرار گرفت و پلیت های حاوی باکتری به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه انکوبه شدند. دیسک حاوی اتانول و متانول به عنوان کنترل در نظر گرفته شد. قطر هاله عدم رشد دیسکها به کمک خط‌کش میلیمتری اندازه‌گیری شد (۲۶).
تعیین حداقل غلظت مهاری و حداقل غلظت کشندگی عصاره
مقادیر MIC و MBC عصاره ترکیبی T.C.P با روش ماکروبراث دایلوشن و طبق برنامه European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) انجام شد. در این روش ۱۰ رقت از محلول عصاره اتانولی و متانولی با روش رقیق‌سازی متوالی تهیه و برای تعیین Minimum Inhibitory Concentration (MIC) و Minimum Bactericidal Concentration (MBC) به کار رفت. سپس ۱ میلیلیتر سوسپانسیون باکتری ۲۴ ساعته به کدورت ۱۰۵×۵ در محیط کشت نوترینت براث به هر رقت (1 میلیلیتر) اضافه شد و به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سلسیوس انکوبه شدند. باکتری به همراه محیط کشت نوترینت براث به عنوان کنترل در نظر گرفته شد. لولهها با کدورت کنترل مقایسه و کمترین غلظتی که رشد باکتری مهارشده داشت، به عنوان MIC در نظر گرفته شد. برای تعین MBC هر یک از عصارهها بدین صورت عمل شد که رقت‌هایی از MIC که هیچ کدورت قابل مشاهده‌ای نداشتند انتخاب شدند. میزان 100 میکرولیتر از این رقت‌ها روی محیط نوترینت آگار به روش سفره‌ای کشت داده و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شد. در نهایت کمترین غلظتی که باکتری پس از انکوباسیون ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سلسیوس رشد نکرد، به عنوان MBC تعیین شد (۲۷).
قابلیت تشکیل بیوفیلم به وسیله سویه‌ها
قابلیت تشکیل بیوفیلم به وسیله سویه‌ها با روش O'Toole and Kolter بررسی شد.
قابلیت عصاره در ممانعت از تشکیل بیوفیلم
تشکیل بیوفیلم توسط O'Toole و Kolter (۲۸) با اندکی تغییرات بررسی شد. ابتدا سه رقت mg/mL ۲۵-6/25 از عصاره اتانولی و متانولی تهیه و ۱۰۰ میکرولیتر آن به چاهک میکروپلیت ۹۶ خانه ای اضافه شد. سپس ۱۰۰ میکرولیتر از سوسپانسیون باکتریایی به چاهک اضافه شد و پلیت ها برای ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سلسیوس انکوبه شدند. چاهک حاوی TSB و آب استریل به عنوان کنترل در نظر گرفته شد. پس از انکوباسیون میکروتیتر پلیت ۳ مرتبه با بافر فسفات سالین(Phosphate-Buffered Saline (PBS)) شسته شد. سپس ۱۵۰ میکرولیتر متانول ۹۶ درصد برای تثبیت سلول های چسبیده اضافه شد و بعد از حذف متانول، ۲۰۰ میکرولیتر کریستال ویوله ۱ درصد به چاهک اضافه و برای 5 دقیقه در دمای ۳۰ درجه انکوبه شد. در آخر ۱۶۰ میکرولیتر اسید استیک گلاسیال ۳۳ درصد به چاهک اضافه و جذب نوری با دستگاه الایزا ریدر (India , Biotec, ELX-800) در طول موج ۶۳۰ نانومتر خوانده شد.
M=100×{(A-B)-(C-D) / (A-B)}
M: درصد مهار تشکیل بیوفیلم،A : میانگین جذب نوری کنترل،B : میانگین جذب نوری کنترل محیط کشت،C : میانگین جذب نوری چاهک آزمون،D : میانگین جذب نوری کنترل عصاره (۲۹).
قابلیت عصاره در تخریب ساختارهای بیوفیلمی تشکیل‌شده
برای تشکیل بیوفیلم ها، 100 میکرولیتر از کشتهای باکتریایی در محیط TSB در چاهکهای میکروپلیت ۹۶ خانه ای به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس انکوباتور شدند. پس از تشکیل بیوفیلم، محیط به‌آرامی خالی شد و سلول های غیرچسبنده با شستن بیوفیلم ها توسط PBS (۲ مرتبه) استریل حذف شدند. برای بررسی اثر عصاره بر روی بیوفیلم از قبل تشکیل شده، هر عصاره به غلظت های مختلف (mg/mL ۲۵-6/25) به چاهک ها اضافه و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس انکوبه شد. مهار بیوفیلم تشکیل‌شده با رنگ‌آمیزی بنفش کریستالی تجزیه و تحلیل شد. درصد کاهش ساختارهای بیوفیلم در حضور غلظت های مختلف عصاره ها با استفاده از فرمول M=100×{(A-B)-(C-D) / (A-B)} محاسبه شد (۳۰).
قابلیت عصاره بر فعالیت آنزیم دهیدروژناز
Hoiby و همکاران (2010) تأثیر عصاره بر فعالیت متابولیک بیوفیلم تشکیل‌شده را با اندکی تغییرات گزارش کرده‌اند. به طور خلاصه، بیوفیلم های ساخته‌شده از قبل ابتدا 2 مرتبه با PBS شسته شدند، سپس عصاره با غلظتهای مختلف (mg/mL ۲۵-6/25) اضافه شد و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس انکوباتور شدند. بعد از انکوباسیون،50 میکرولیتر از محلول تری فنیل تترازولیوم کلراید(Triphenyl Tetrazolium Chloride (TTC) ) به هر چاهک اضافه شد و به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس انکوبه شدند. سپس جذب نهایی در 490 نانومتر با استفاده دستگاه الایزا ریدر (India , Biotec, ELX-800) در طول موج۶۳۰ نانومتر خوانده شد. درصد کاهش فعالیت متابولیک بیوفیلم در حضور غلظت های مختلف عصارهها با استفاده از فرمول
M=100×{(A-B)-(C-D) / (A-B)} محاسبه شد (۳۱).
تحلیل آماری یافته‌ها
تمام آزمون ها با سه بار تکرار انجام شد و اختلاف میان داده‌ها با استفاده از تحلیل واریانس (ANOVA) و SPSS نسخه 18 برای ویندوز و در سطح معنی‌داری 0/05 بررسی شد.
یافته ها
اثراث مهاری عصاره ترکیبی در برابر فرم منفرد باکتریهای
میانگین قطر هاله مهاری، مقادیر MIC و MBC عصاره ترکیبی T.C.P در جدول ۱ آورده شده است. بر اساس مشاهدات انجام‌شده باکتری سودوموناس ائروزینوزا بیشترین حساسیت (1/12±۲۱) و باکتری کلبسیلا پنومونیهکمترین حساسیت (0/89±۸) را به عصاره متانولی نشان داد. مقادیر MIC و MBC برای ترکیب T.C.P بر باکتریهای مطالعه‌شده در محدوده غلظتیmg/mL 50-25 به دست آمد. MIC برای عصاره متانولی بر باسیلوس سرئوس و سودوموناس ائروزینوزا و برای عصاره اتانولی باکتریهای استافیلوکوکوس اورئوس و اشریشیا کلی مشاهده نشد. MBC برای عصاره اتانولی باکتری سودوموناس ائروزینوزا و کلبسیلا پنومونیه و عصاره متانولی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس و اسینتوباکتر بومانی دیده نشد.
جدول ۱. میانگین قطر هاله مهاری (mm) مقادیر MIC و MBC عصاره ترکیبی T.C.P (mg/ml)
اثرات مهاری عصاره ترکیبی T.C.P در برابر تشکیل بیوفیلم
قابلیت هریک از غلظت های مختلف عصاره ترکیبی T.C.P بر تشکیل بیوفیلم در شکل ۱ نشان داده شده است. بر این اساس بیشترین مهار تشکیل بیوفیلم در تیمار با عصاره متانولی با غلظت mg/mL 25 بر روی استافیلوکوکوس اورئوس (98/13 درصد) و کمترین اثر مهاری مربوط به همین عصاره با غلظت mg/mL 6/25 بر روی سویه‌ی سودوموناس ائروزینوزا (6/91 درصد) مشاهده شد. اثر عصاره ترکیبی T.C.P بر باکتریهای مختلف در مهار تشکیل بیوفیلم معنی‌دار بوده است (0/05>P).
قابلیت هریک از غلظت های مختلف عصاره ترکیبی T.C.P بر تشکیل بیوفیلم در شکل ۱ نشان داده شده است. بر این اساس بیشترین مهار تشکیل بیوفیلم در تیمار با عصاره متانولی با غلظت mg/mL 25 بر روی استافیلوکوکوس اورئوس (98/13 درصد) و کمترین اثر مهاری مربوط به همین عصاره با غلظت mg/mL 6/25 بر روی سویه‌ی سودوموناس ائروزینوزا (6/91 درصد) مشاهده شد. اثر عصاره ترکیبی T.C.P بر باکتریهای مختلف در مهار تشکیل بیوفیلم معنی‌دار بوده است (0/05>P).
شکل ۱. مقایسه تأثیر عصاره ترکیبی T.C.P بر تشکیل بیوفیلم باکتریها
اثرات مهاری عصاره ترکیبی در برابر تخریب بیوفیلم تشکیل شده
قابلیت هریک از غلظت های مختلف عصاره های ترکیبی T.C.P در تخریب ساختارهای بیوفیلمی بررسی‌شده در شکل ۲ آمده است. بیشترین تخریب ساختارهای بیوفیلمی در تیمار با عصاره متانولی در غلظت mg/mL 25 بر روی سویه‌ی استافیلوکوکوس اورئوس (96/3 درصد) و کمترین تخریب مربوط به عصاره‌ی اتانولی در غلظت mg/mL 6/25 بر روی سویه‌ی اسینتوباکتر بومانی (22/08 درصد) مشاهده شد. اثر عصاره ترکیبی T.C.P به صورت جداگانه معنی‌دار است (0/05>P).
قابلیت هریک از غلظت های مختلف عصاره های ترکیبی T.C.P در تخریب ساختارهای بیوفیلمی بررسی‌شده در شکل ۲ آمده است. بیشترین تخریب ساختارهای بیوفیلمی در تیمار با عصاره متانولی در غلظت mg/mL 25 بر روی سویه‌ی استافیلوکوکوس اورئوس (96/3 درصد) و کمترین تخریب مربوط به عصاره‌ی اتانولی در غلظت mg/mL 6/25 بر روی سویه‌ی اسینتوباکتر بومانی (22/08 درصد) مشاهده شد. اثر عصاره ترکیبی T.C.P به صورت جداگانه معنی‌دار است (0/05>P).
شکل ۲. مقایسه تأثیر عصاره ترکیبی T.C.P بر بیوفیلم تشکیل‌شده باکتریها
اثرات مهاری عصاره ترکیبی بر فعالیت آنزیم دهیدروژناز
قابلیت هریک از غلظت های مختلف عصاره ی ترکیبی T.C.P بر فعالیت آنزیم دهیدروژناز باکتریهای بررسی‌شده در شکلهای ۳ و ۴ آمده است. بیشترین مهار فعالیت آنزیمی در تیمار با عصاره‌ی اتانولی و متانولی در غلظت mg/mL 25 بر روی سویه اشریشیاکلی (0/6=OD) و سودوموناس ائروزینوزا (0/7=OD) بود. همچنین کمترین مهار آنزیمی در تیمار با عصاره اتانولی در غلظت mg/mL 6/25 بر روی سویه‌های اشریشیا کلی و باسیلوس سرئوس (1/9=OD) و کلبسیلا پنومونیه (1/9=OD) مشاهده شد. اثر عصاره ترکیبی T.C.P بر باکتریهای مختلف بر فعالیت آنزیم دهیدروژناز معنی‌دار است (0/05>P).
قابلیت هریک از غلظت های مختلف عصاره ی ترکیبی T.C.P بر فعالیت آنزیم دهیدروژناز باکتریهای بررسی‌شده در شکلهای ۳ و ۴ آمده است. بیشترین مهار فعالیت آنزیمی در تیمار با عصاره‌ی اتانولی و متانولی در غلظت mg/mL 25 بر روی سویه اشریشیاکلی (0/6=OD) و سودوموناس ائروزینوزا (0/7=OD) بود. همچنین کمترین مهار آنزیمی در تیمار با عصاره اتانولی در غلظت mg/mL 6/25 بر روی سویه‌های اشریشیا کلی و باسیلوس سرئوس (1/9=OD) و کلبسیلا پنومونیه (1/9=OD) مشاهده شد. اثر عصاره ترکیبی T.C.P بر باکتریهای مختلف بر فعالیت آنزیم دهیدروژناز معنی‌دار است (0/05>P).
شکل ۳. مقایسه تأثیر عصاره اتانولی ترکیب T.C.P بر آنزیم دهیدروژناز باکتریها
شکل ۴. مقایسه تأثیر عصاره متانولی ترکیب T.C.P بر آنزیم دهیدروژناز باکتریها
بحث
امروزه یکی از دلایل اصلی ایجاد عفونت در انسان، مقاومت آنتی‌بیوتیکی باکتری ها به علت مصرف آنتی‌بیوتیک است که موجب ظهور و گسترش سویه های باکتری مقاوم به آنتی‌بیوتیک می شود. بیش از ۸۰ درصد از باکتری های عفونت‌زا در انسان، ساختارهای بیوفیلمی تشکیل می دهند. بنابراین تلاش‌های فراوانی برای دستیابی به اطلاعات بیشتر در مورد مواد مؤثره موجود در گیاهان و کاربرد آنها در درمان عفونت های مختلف و کنترل بیوفیلم در حال انجام است (۳۴-۳۲). استفاده از مواد ضدمیکروبی با پایه گیاهی می‌تواند در کنترل تشکیل بیوفیلم و بیماریهای عفونی نقش باارزشی ایفا کن؛ به طوری که ۸۰ درصد از مردم کشورهای توسعه‌یافته از گیاهان دارویی برای درمان بیماری های مختلف استفاده می کنند (۳۵).
اگرچه فعالیت ضدباکتریایی و ضدقارچی زیادی از عصاره های گیاهی گزارش شده است، ولی اثربخشی آنها در برابر باکتری های مقاوم به آنتی‌بیوتیک بسیار کم است. در همین راستا، در این مطالعه خواص ضدباکتریایی عصاره ترکیبی T.C.P بر شش گونه باکتری مقاوم به آنتی‌بیوتیک بررسی شد. نتایج مطالعه حاضر در آزمون انتشار دیسک، MICو MBC نشان می دهد عصاره ترکیبی T.C.P توانایی زیادی در جلوگیری از رشد باکتری های مقاوم به آنتی‌بیوتیک دارد؛ به طوری که بیشترین قطر هاله عدم رشد عصاره اتانولی و متانولی ترکیب T.C.P مربوطه به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (mm 0/77±۲۰) و سودوموناس ائروزینوزا (mm 1/12±۲۱) بود. همچنین مقادیر MIC و MBC برای عصاره ترکیبی T.C.P بر باکتریهای مطالعه‌شده در محدوده غلظتی mg/mL 50-۲۵ به دست آمد که بیشترین غلظت مهارکنندگی عصاره اتانولی و متانولی به ترتیب مربوطه به باکتری سودوموناس ائروزینوزا mg/mL) 0/28±۵۰) و استافیلوکوکوس اورئوس (mg/mL 1/23±۵۰) به دست آمد.
در مطالعات Cui و همکارانش در سال ۲۰۱۲، Radji و همکارانش در سال ۲۰۱۳ و Liaqat و همکارانش در سال ۲۰۱۶، نتایج مشابهی اثر مهارکنندگی عصاره چای سبز بر باکتری های استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA))،
سودوموناس ائروزینوزا مقاوم به چند دارو (Multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa (MDR-P. aeruginosa))،، استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سرئوس، سودوموناس ائروزینوزا، اشریشیا کلی و کلبسیلا پنومونیه را تأیید میکند که این خاصیت را به طور کلی به ترکیبات پلی فنول درون عصاره چای سبز در برابر باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی مرتبط دانستند (38-36). همچنین مطالعات Darabpour و همکارانش در سال ۲۰۱۰ و Hatano و همکارانش در سال ۲۰۰۵ اثر مهاری عصاره کلپوره بر باکتری استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین و باکتریهای باسیلوس سرئوس، استافیلوکوکوس اورئوس و اشریشیا کلی را تأیید می کنند (40 ،39). Karsha و همکارانش در سال ۲۰۱۰ و Sabaghi و همکارانش در سال ۲۰۱۴ اثر بازدارندگی عصاره فلفل سیاه در برابر باکتریهای استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به آنتی‌بیوتیک، استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سرئوس، سودوموناس ائروزینوزا، اشریشیا کلی و کلبسیلا پنومونیه را نشان دادند. در مطالعات آنها این عصاره در غلظتهای۱۰، 1/25، 2/50، 6/25، 1/25 و 1/25 mg/mL بیشترین اثر بازدارندگی را داشت (41،42).
تفاوت میان اثربخشی عصاره در آزمون انتشار دیسک، MIC و MBC احتمالا به علت تفاوت در انتشار عصاره از دیسکهای حاوی آن و انتشار در محیط مایع آزمون است. به طور کلی حلال اتانولی به طور مؤثرتری نسبت به حلال متانولی توانسته است با اجزا و مواد تشکیل‌دهنده عصاره ترکیبی T.C.P واکنش ایجاد کند و باعث افزایش خروج مواد مؤثر از گیاه و بالا رفتن غلظت این مواد در عصاره اتانولی نسبت به عصاره متانولی T.C.P شود. اثرات ضدباکتریایی این عصاره ترکیبی ممکن است به خاطر ترکیبات موجود در عصاره باشد که میکروارگانیسم‌ها هرگز در معرض آن قرار نگرفته‌اند. بنابراین هرگز فرصتی برای ایجاد مقاومت نداشته‌اند. همچنین ترکیبات شناخته‌شده درون عصاره این سه گیاه دارویی شامل پلی‌فنل ها، تانن ها، آلفا و بتا پینن ها و غیره می تواند باعث رسوب پروتئین های باکتری، مهار فعالیت آنزیمی، تخریب غشا و در نتیجه مرگ میکروارگانیسم شود (47-43).
گیاهان نقش مهمی در از بین‌بردن شکل‌گیری بیوفیلم باکتری های بیماریزا دارند. ترکیبات عصاره آنها مانع از شکل‌گیری و توسعه بیوفیلم می شود. در مطالعه حاضر عصاره ترکیبی T.C.P در مقابله با ساختار بیوفیلم کارآمد بود. اثر بازدارنده عصاره به طور مستقیم با غلظت ارتباط دارد. توانایی عصاره اتانولی در مهار بیوفیلم بیشتر از تخریب بیوفیلم یا جلوگیری از فعالیت متابولیک سلول میکروبی در ساختار بیوفیلم بود که می توان نتیجه گرفت عصاره اتانولی حاوی مولکولی است که با تشکیل بیوفیلم باکتری در ارتباط است، اما این عصاره توانایی کمی برای مقابله با ساختار بیوفیلم دارد. تفاوت بین نتایج مشاهدات ما احتمالا به دلیل مواد شیمیایی متنوع آنها در گونه های مختلف گیاهی به‌ویژه در روش استخراج آنهاست. در مطالعات Agrawal در سال ۲۰۱۱ و Gibbons در سال ۲۰۰۴ نشان داده شد عصاره چای سبز باعث مهار تشکیل بیوفیلم در باکتری های اشریشیا کلی، استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس ائروزینوزا میشود که مطابق با تحقیقات انجام‌شده است (49،48). همچنین گزارش شده است که عصاره این گیاهان با اثرگذاری روی چسبندگی و سیستم کوئروم سنسینگ باکتری ها مانع از شکل‌گیری بیوفیلم میشود (۵۰).
براساس نتایج حاصل از این پژوهش، می توان نتیجه گرفت عصاره ترکیبی T.C.P در شرایط آزمایشگاهی قابلیت مهار ۶ باکتری مقاوم به آنتی‌بیوتیک را دارد . بر این اساس می توان از این عصاره برای بهبود عملکرد آنتی‌بیوتیک‌ها یا حتی جایگزین آنها استفاده کرد.
سپاسگزاری
نویسندگان این مقاله از معاونت پژوهشی دانشگاه شهید باهنر کرمان به خاطر حمایت مالی صمیمانه سپاسگزاری می‌کنند.
تعارض منافع
بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشی |
موضوع مقاله:
مواد ضد میکروبی
دریافت: 1396/7/17 | پذیرش: 1398/4/31 | انتشار الکترونیک: 1398/6/24
دریافت: 1396/7/17 | پذیرش: 1398/4/31 | انتشار الکترونیک: 1398/6/24
فهرست منابع
1. Mohsenipour Z, Hassanshahian M. Comparison of Antimicrobial Effects of Pomegranate Alcohol Extract on Single and Biofilm Form of Six Pathogenic Bacteria. Journal of Babol University of Medical Science. 2014; 17(1):77-84.
2. Mohsenipour Z, Hassanshahian, M. Antibacterial Activity of Euphorbia Hebecarpa Alcoholic Extracts Against Six Human Pathogenic Bacteria in Planktonic and Biofilm Forms. Jundishapur Journal of Microbiology. 2016; 9(6):e34701. [DOI:10.5812/jjm.34701] [PMID] [PMCID]
3. Sadeghian I, Hassanshahian, M, Sadeghian S, Jamali S. Antimicrobial Effects of Quercus Brantii Fruits on Bacterial Pathogens. Jundishapur Journal of Microbiology. 2012; 5(3):465-9. [DOI:10.5812/jjm.3376]
4. Mohammadi M, Masoumipour F, Hassanshahian M, Jafarinasab T. Study the antibacterial and antibiofilm activity of Carum copticum against antibiotic-resistant bacteria in planktonic and biofilm forms. Microbial Pathogenesis. 2019; 129:99-105. [DOI:10.1016/j.micpath.2019.02.002] [PMID]
5. Saeidi S, Amini Boroujeni N, Ahmadi H, Hassanshahian M. Antibacterial Activity of Some Plant Extracts Against Extended- Spectrum Beta-Lactamase Producing Escherichia coli Isolates. Jundishapur Journal of Microbiology. 2015; 8(2):e15434. [DOI:10.5812/jjm.15434] [PMID] [PMCID]
6. Mohsenipour Z, Hassanshahian M. The Inhibitory Effect of Thymus Vulgaris Extracts on the Planktonic Form and Biofilm Structures of Six Human Pathogenic Bacteria. Avicenna Journal Phytomedicine. 2015; 5(4):309-17.
7. Sepehri Z, Javadian F, Khammari D, Hassanshahian M. Antifungal Effects of the Aqueous and Ethanolic Leaf Extracts of Echinophora Platyloba and Rosmarinus Officinalis. Current Medical Mycology. 2016; 2(1):16-25. [DOI:10.18869/acadpub.cmm.2.1.30] [PMID] [PMCID]
8. Mohsenipour Z, Hassanshahian M, Moradi M. Investigations of Antimicrobial Activity of Eucalyptus Camaldulensis Extracts Against Six Pathogenic Bacteria in Planktonic Form and Biofilm. Journal of Kerman University of Medical Science. 2015; 22(2):172-84.
9. Masoumipour F, Hassanshahian M, Jafarinasab T. Antimicrobial Activity of Combined Extracts of Trachyspermum, Thymus and Pistachio Against Some Pathogenic Bacteria. Journal of Kerman University of Medical Science. 2018; 25(2):153-63.
10. Savithramma N, Linga Rao M, Suhrulatha D. Screening of Medicinal Plants for Secondary Metabolites. Middle East Journal Science Research. 2011; 8(3):579-84
11. Hassanshahian M, Bayat Z, Saeidi S, Shiri Y. Antimicrobial Activity of Trachyspermum Ammi Essential Oil Against Human Bacterial. International Journal Advance Biological Biomed Research. 2014; 2(1):18-24.
12. Chakraborty B, Nath A, Saikia H, Sengupta M. Bactericidal Activity of Selected Medicinal Plants Against Multidrug Resistant Bacterial Strains From Clinical Isolates. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 2014; 7:435-41. [DOI:10.1016/S1995-7645(14)60271-6]
13. Saeidi S, Shiri Y, Bokaeian M, Hassanshahian M. Antibacterial Activity of Essential Oil of Saturejahortensis Against Multi-Drug Resistant Bacteria. International Journal Enteric Pathogen. 2013; 2(2):1-4. [DOI:10.17795/ijep16349]
14. Weinstine RA. Controlling Antimicrobial Resistance in Hospitals: Infection Control and Use Of Antibiotics. Emerging Infectious Diseases. 2001; 7(2):188-92. [DOI:10.3201/eid0702.010206] [PMID]
15. Bokaeian M, Sheikh M, Hassanshahian M, Saeidi S, Sahraei S. The Antibacterial Activity of Silver Nanoparticles Produced in the Plant Sesamum Indicum Seed Extract: A Green Method Against Multi-Drug Resistant Escherichia Coli. International Journal Enteric Pathogen. 2014; 2(2):e17928. [DOI:10.17795/ijep17928]
16. Rezaie Keikhaie K, Ghorbani S, Hosseinzadeh Z, Hassanshahian M. Antimicrobial Activity of Methanol Extract of Citrullus Colocynthis Against Antibiotic-Resistant Staphylococcus Aureus. Advance Herbal Medicine 2017; 3(3):1-6.
17. Hassanshahian M, Khosravi F. Study the Antimicrobial Effects of Artemisia Santonica Extract on Some Pathogenic Bacteria. Advance Herbal Medicine .2015; 1(4):43-6.
18. Mohsenipour Z, Hassanshahian M. Antibacterial activity of Espand (Peganum Harmala) Alcoholic Extracts Against Six Pathogenic Bacteria in Planktonic and Biofilm Forms. Biological Journal Microorganism. 2016; 4(16):47-57. [DOI:10.5812/jjm.34701] [PMID] [PMCID]
19. Javadian F, Sepehri Z, Saeedi S, Hassanshahian M. Antifungal Effects of the Extract of the Withania Somnifera on Candida Albicans. Advance Herbal Medicine. 2016; 2(1):32-43.
20. Hamayeli H, Shoshtari A, Hassanshahian M, Askari M. Study the Antimicrobial Activity of Six Marine Sponges and Three Parts of Sea Anemone on Candida Albicans. Journal Coastal Life Medicine. 2016; 4(8):122-9. [DOI:10.12980/jclm.4.2016J6-76]
21. Mashhadi M, Fakhri J, Saeedi S, Hassanshahian M, Abkhoo A. Antimicrobial Effects of Medicinal Plants Collected in Zabol, Iran, on Pathogenic Food Pathogenic. Journal of Medical Bacteriology. 2016; 5(3):18-28.
22. Jahani Z, Hosseinzadeh F, Shahi Z, Shikhzadeh M, Hassanshahian M, Saeedi S. In Vitro Study of Antimicrobial Effects of Rosmarinus Officinalis and Glycyrrhiza Glabra Extracts Against Some Pathogens. Advance Herbal Medicine. 2016; 2(4):32-9.
23. Heydari F, Saeedi S, Hassanshahian M. Antibacterial Activity of Mentha Longifolia Against Salmonella Typhimurium. Advance Herbal Medicine. 2015; 1(3):42-7.
24. Mohsenipour Z, Hassanshahian M. Investigating the Effectiveness of Centaureacyanus Extracts on Planktonic Growth and Biofilm Structures of Six Pathogenic Bacteria. SSU Journals. 2014; 22(4):1358-70.
25. Mohsenipour Z, Hassanshahian M. Inhibitory Effects of Tamarix Hispida Extracts on Planktonic Form and Biofilm Formation of Six Pathogenic Bacteria. Biological Journal Microbiology. 2015; 4(13):25-36.
26. Sepehri Z, Hassanshahian M, Shahi Z, Nasiri A, Baigi S. Antibacterial Effect of Ethanol Extract of Camellia Sinensis L Against Escherichia Coli. Asian Pacific Journal Microbiology Research. 2014; 2(1):6-8.
27. Rezaie Keikhaie K, Bagheri G, Hassanshahian M, Saeidi S. Antimicrobial Effects of Zataria Multiflora Essential Oils on Acinetobacter Strains Isolated From Clinical Specimens. Journal Herbal Drug. 2018; 8(4):251-6. [DOI:10.14196/JHD.2018.251]
28. Jabra Rizk MA, Meiller TF, James CE, Shirtliff ME. Effect of Farnesol on Staphylococcus Aureus Biofilm Formation and Antimicrobial Susceptibility. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2006; 50(4):1463-9. [DOI:10.1128/AAC.50.4.1463-1469.2006] [PMID] [PMCID]
29. Sandasi M. The Effect of Plant Extraction on Microbial Biofilm Formation and Development [Master thesis]. Pretoria: Tshwane University of Technology; 2008.
30. Ramage G, López-Rib JL. Techniques for Antifungal Susceptibility Testing of Candida Albicans Biofilms. In: Ernest EJ, Rogers PD, editors. Antifungal Agents. Totowa, New Jersey: Humana Press; 2005.
31. Høiby N, Bjarnsholt T, Givskov M, Molin S, Ciofu O. Antibiotic Resistance of Bacterial Biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 2010; 35(4):322-32. [DOI:10.1016/j.ijantimicag.2009.12.011] [PMID]
32. Stanisavljević I, Stojičević S, Veličković D, Veljković V, Lazić M. Antioxidant and Antimicrobial Activities of Echinacea (Echinacea Purpurea L.) Extracts Obtained by Classical and Ultrasound Extraction. Chinese Journal of Chemical Engineering. 2009; 17(3):478-83. [DOI:10.1016/S1004-9541(08)60234-7]
33. Hoiby N, Bjarnsholt T, Givskov M, Molin S, Ciofu O. Antibiotic Resistance of Bacterial Biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 2010; 35:322-32. [DOI:10.1016/j.ijantimicag.2009.12.011] [PMID]
34. Ghotaslou R, Salahi B. Effects of Oxygen on In-Vitro Biofilm Formation and Antimicrobial Resistance of Pseudomonas Aeruginosae. Pharmaceutical Sciences. 2013; 19(3):96.
35. Nascimento GG, Locatelli J, Freitas PC, Silva GL. Antibacterial Activity of Plant Extracts and Phytochemicals on Antibiotic-Resistant Bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 2000; 31(4):247-56. [DOI:10.1590/S1517-83822000000400003]
36. Cui Y, Oh YJ, Lim J, Youn M, Lee I, Pak HK, et al. AFM Study of the Differential Inhibitory Effects of the Green Tea Polyphenol Epigallocatechin-3-Gallate (Egcg) Against Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria. Food Microbiology. 2012; 29(1):80-7. [DOI:10.1016/j.fm.2011.08.019] [PMID]
37. Radji M, Agustama RA, Elya B, Tjampakasari CR. Antimicrobial Activity of Green Tea Extract Against Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus and Multi-Drug Resistant Pseudomonas Aeruginosa. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2013; 3(8):663-7. [DOI:10.1016/S2221-1691(13)60133-1]
38. Liaqat I, Pervaiz Q, Bukhsh SJ, Ahmed SI, Jahan N. Investigation of Bactericidal Effects of Medicinal Plant Extracts on Clinical Isolates and Monitoring Their Biofilm Forming Potential. Pakistan Veterinary Journal. 2016; 36(2):159-64.
39. Darabpour E, Motamedi H, Nejad SM. Antimicrobial Properties of Teucrium Polium Against Some Clinical Pathogens. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 2010; 3(2):124-7. [DOI:10.1016/S1995-7645(10)60050-8]
40. Hatano T, Kusuda M, Inada K, Ogawa TO, Shiota S, Tsuchiya T, et al. Effects of Tannins and Related Polyphenols on Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus. Phytochemistry. 2005; 66(17):2047-55. [DOI:10.1016/j.phytochem.2005.01.013] [PMID]
41. Karsha PV, Lakshmi OB. Antibacterial Activity of Black Pepper (Piper Nigrum Linn.) With Special Reference to Its Mode of Action on Bacteria. Indian Journal of Natural Products and Resources. 2010; 1(2):213-15.
42. Sabbagh SK, Saeedi S, Dehbashi Z, Naeeini MM. Antimicrobial Activity of Ethanolic Extract of Black Pepper (Piper Nigrum) and March (Peganum Harmala) Against Antibiotic-resistant of Staphylococcus Aureus Strains. Bimonthly Journal of Sabzevar University of Medical Sciences. 2014; 22(5).
43. Erasto P, Bojase MoletaG, Majinda RRT. Antimicrobial and Antioxidant Flavonoids From the Roots Wood of Bolusathusspesiosus. Phytochem. 2004; 65:875-80. [DOI:10.1016/j.phytochem.2004.02.011] [PMID]
44. Viljoen A, Van Vuuren S, Ernst E, Klepser M, Demirci B, Başer H, et al. Osmitopsis Asteriscoides (Asteraceae)-the Antimicrobial Activity and Essential Oil Composition of A Cape-Dutch Remedy. Journal of Ethnopharmacology. 2003; 88(2):137-43. [DOI:10.1016/S0378-8741(03)00191-0]
45. Kali A. Antibiotics and Bioactive Natural Products in Treatment of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus: A Brief Review. Pharmacognosy Reviews. 2015; 9(17):29. [DOI:10.4103/0973-7847.156329] [PMID] [PMCID]
46. Thakur P, Chawla R, Chakotiya AS, Tanwar A, Goel R, Narula A, et al. Camellia Sinensis Ameliorates the Efficacy of Last Line Antibiotics Against Carbapenem Resistant Escherichia Coli. Phytotherapy Research. 2016; 30(2):314-22. [DOI:10.1002/ptr.5535] [PMID]
47. Farooqui A, Khan A, Borghetto I, Kazmi SU, Rubino S, Paglietti B. Synergistic Antimicrobial Activity of Camellia Sinensis and Juglans Regia Against Multidrug-Resistant Bacteria. PloS One. 2015; 10(2):e0118431. [DOI:10.1371/journal.pone.0118431] [PMID] [PMCID]
48. Agrawal I. Susceptibility of Bacterial Biofilms Against Some Leaf Extracts. Plant Sciences Feed. 2011; 1(5):69-73.
49. Gibbons S. Anti-Staphylococcal Plant Natural Products. Natural Product Reports. 2004; 21(2):263-77. [DOI:10.1039/b212695h] [PMID]
50. Simoes M, Bennett RN, Rosa EA. Understanding Antimicrobial Activities of Phytochemicals Against Multidrug Resistant Bacteria and Biofilms. Natural Product Reports. 2009; 26(6):746-57. [DOI:10.1039/b821648g] [PMID]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
