سال 13، شماره 1 - ( فروردین - اردیهبشت 1398 )
جلد 13 شماره 1 صفحات 79-69 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Kalteh S, Ojagh S M, Tabarrayi A, Zolfaghari M. Investigating the Possibility of the Listeria Monocytogenes Entering Into a Viable But Non-Culturable (VBNC) Form and Expression of the Pathogenic Genes During the Frozen Storage of (-18ºC) Rainbow Trout Fish Nugget. Iran J Med Microbiol 2019; 13 (1) :69-79
URL: http://ijmm.ir/article-1-910-fa.html
URL: http://ijmm.ir/article-1-910-fa.html
کلته صونا، اجاق سید مهدی، تبرائی علیجان، ذوالفقاری مهدی. بررسی امکان ورود باکتری Listeria monocytogenes به حالت زنده اما غیرقابل کشت و بیان ژن های بیماری زایی آن طی دوره انجماد (ºC18-) ناگت ماهی قزل آلای رنگین‌کمان (Oncorhynchus Mykiss). مجله میکروب شناسی پزشکی ایران. 1398; 13 (1) :69-79
صونا کلته1 
، سید مهدی اجاق 2، علیجان تبرائی3 ، مهدی ذوالفقاری1
، سید مهدی اجاق 2، علیجان تبرائی3 ، مهدی ذوالفقاری1
1- گروه شیلات، دانشکده شیلات و محیط زیست، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران
2- گروه شیلات، دانشکده شیلات و محیط زیست، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران ، Mahdi_ojagh@yahoo.com
3- گروه میکروب شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی گلستان، گرگان، ایران
2- گروه شیلات، دانشکده شیلات و محیط زیست، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران ، Mahdi_ojagh@yahoo.com
3- گروه میکروب شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی گلستان، گرگان، ایران
متن کامل [PDF 927 kb]
(1981 دریافت)
| چکیده (HTML) (6868 مشاهده)
Listeria monocytogenes گروهی از باکتری‌های گرم مثبت، میله‌ای‌شکل، بدون اسپور، کاتالاز مثبت و اکسیداز منفی هستند (1). فرم بدون اسپور این باکتری به فریزکردن و خشک‌کردن مقاوم است. لیستریا میتواند درجه حرارت کم (ºC0/4-) و بازۀ گستردهای از pH (3/6 تا 9/6) و همچنین فعالیت آبی (aw) نسبتاً کم و غلظت زیاد نمک (10 درصد<) را تحمل کند (2). نگرانی رو به رشد در دهه های گذشته ورود L. monocytogenes به غذاها بوده است (3). این پاتوژن منجر به بیماری لیستریوزیس میشود؛ یک بیماری نادر اما جدی، به‌ویژه برای گروه در خطر (3) که غالباً شامل بزرگسالان دچار نقص ایمنی، افراد مسن، نوزادان تازه متولدشده و زنان باردار هستند و همراه با سقط جنین، مردهزایی، سپتی‌سمی و مننژیت است (4). در سال 2007 در اتحادیه اروپا 0/3 مورد در هر 100هزار مورد با نرخ مرگ‌ومیر 20 درصد ناشی از لیستریوزیس گزارش شده است (3).
موارد متعددی از شیوع لیستریوزیس در اثر مصرف غذاهای دریایی گزارش شده است (5). برخی از کشورها حد مجاز صفر را برای L. monocytogenes در ماهی های وارداتی در نظر گرفته اند. بنابراین تقاضای تولیدکنندگان محصولات دریایی برای مواد خام عاری از L. monocytogenes در طول فرآوری محصولات دریایی اهمیت قابل توجهی دارد (6). L. monocytogenes از محصولات دریایی مثل ماهی دودی، محصولات دریایی پخته و منجمد، ترشی ماهی و سوریمی جداسازی شده است (7). با اینکه 13 سروتیپ از سویه L. monocytogenes شناسایی شده اند، اغلب موارد انسانی شامل سروتی پهای 1.2a، 1.2b و 4b است (8-10) سروتیپ 4b مسئول شیوع بسیاری از موارد لیستریوزیس با منشأ غذایی است (9). این پاتوژن تحت شرایط استرس زای مختلف از جمله انکوباسیون خارج از دمای بهینه رشد، شوری زیاد، افزایش فشار اسمزی، غلظت اکسیژن، نور مرئی، گرسنگی و فرایندهایی که تصور می شود منجر به نابودی باکتری می شود، وارد حالت «زنده اما غیرقابل کشت»[1] می شود (11-15). این تعریف برای حالتی است که باکتری به دلیل حفظ فعالیت متابولیکی زنده است، اما قابلیت کشت و رشد را ندارد. بنابراین کلنیها را در محیطهای اختصاصی کشت معمول توسعه نمی دهد (6). به نظر میرسد عوامل بیماریزایی شامل actA، hly، iap، inlA وplcA نقش ویژه‌ای در بیماریزایی L. monocytogenes دارند (16-20). hly کدکننده لیستریولیزین O است که برای لیز حفره مانند و ورود به سیتوزول سلول ضروری است (17). ژن inlA عملکرد مهمی در تهاجم باکتری با مکانیسم انتروسیتوز[2] دارد (19).
از آنجایی که لیستریولایزین O (hly) عامل بیماریزای مهمی در L. monocytogenes است، بیان ژن hly در فاز VBNC نشان‌دهنده توانایی بیماریزایی باکتری در این فاز VBNC است (11-22). در این راستا توانایی ورود L. monocytogenes جداشده از سالمون خام، محیط فرآوری این ماهی و بیماران مبتلا به لیستریوزیس، به فاز VBNCو نیز بیماریزایی آن ارزیابی و بررسی شده است. این ارزیابی‌ها نشان داده است همه سویه ها پس از گرسنگی وارد فازVBNC میشوند و در حضور سدیم پیروات و تغذیه با مواد غذایی جایگزین احیاء نمی شوند (23). همچنین این مطالعات نشان داده است همزمان با از دست‌رفتن قابلیت کشت، خاصیت بیماریزایی نیز از دست می رود. همچنین عنوان شده است سویه های L. monocytogenes ممکن است در محیط آبی برای دوره های طولانی تری در فاز VBNC بمانند، اما این سلول‌ها بیماریزا نیستند (24). انجماد محصول فرآوری‌‌شده روشی مناسب برای جلوگیری از رشد L. monocytogenes است. هر چند L. monocytogenes (در صورت وجود) در محصول نهایی یا فرآوری‌‌شده با انجماد از بین نمی رود، اما رشد آن طی دوره انجماد متوقف خواهد شد. انجماد و ذخیره طولانی مدت به شکل منجمد میتواند تأثیراتی منفی روی خواص محصول بگذارد. همچنین، با وجود نگهداری محصول فرآوری‌‌شده در فریزر به صورت طولانی مدت، انجمادزدایی میتواند منجر به رشد L. monocytogenes در محصول فرآوری‌‌شده شود (25). پس از انجماد گونههای مختلف، انواع متفاوتی از بقا را در ارتباط با اندازه سلول و شکل و ساختار آن نشان دادهاند. باکتریهایی با اندازه بزرگ‌تر و پیچیدگی بیشتر در مقابل آسیبهای انجماد نسبت به انواع کوچک‌تر و سادهتر مقاومت کمتری دارند (26، 27). توانایی ورود L. monocytogenes به فاز VBNC طی استرسهای حین فرآوری نگران‌کننده است؛ به دلیل آنکه آزمونهای باکتریولوژیکی کشت معمول، موفق به شناسایی ارگانیسمهای غیرقابل کشت در محصول و محیط فرآوری نشده و ریسک خطر مصرف لیستریا مونوسیتوژنز در فاز VBNC هنوز ناشناخته است. یکی از این استرسها انجماد است. به همین دلیل هدف از این مطالعه بررسی امکان ورود L. monocytogenes به حالت VBNC طی انجماد ºC18- با استفاده از بررسی بیان ژن 16S rRNA و بررسی بیماریزایی آن با استفاده از ژنهای hly و inlA است.
باکتری L. monocytogenes سویه استاندارد ATCC 19115 (سروتیپ 4b)، از سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران در سال 1397 به صورت لیوفیلیزه تهیه شد. باکتریها در محیط BHI براث به مدت 24 ساعت در ºC37 انکوبه شدند. سپس روی محیط BHI آگار کشت شدند و 24 ساعت در ºC37 انکوبه و یک کلونی خالص از آن برای ادامه مطالعات استفاده شد.
محیطهای بررسی‌شده
امکان ورود باکتری L. monocytogenes به حالت VBNC در دمای انجماد ºC18- در سه محیط سرم فیزیولوژی (NS)Normal saline (به عنوان شرایط نبود مواد تغذیه‌ای و ماتریکس محافظت‌کننده) BHI براث (شرایط محیط تغذیه‌ای غنی) و آبگوشت ماهی یا Fish Broth (FB) (شرایط ماتریکس گوشت ماهی) قزل‌آلای رنگین‌کمان (Oncorhynchus mykiss) بررسی شد. محیط BHI براث طبق برنامه شرکت مربوطه آماده‌سازی و اتوکلاو شد.
آماده‌سازی محیط آبگوشت ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان (FB)
عصاره ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان به روش Nilsson و همکاران (1999) آماده شد. در این روش ابتدا ماهی قزل‌آلا تمیز (پوست‌کنی و تخلیه امعا و احشا) و چرخ شد. در ادامه با آب مقطر به نسبت 1:2 (وزنی/حجمی) به مدت 10 دقیقه جوشانده و به مدت 10 دقیقه فیلتر شد. عصاره حاصل با افزودن 5/98 گرم در لیتر KH2PO4 و 9/75 گرم در لیتر K2HPO4 بافری و pH آن با استفاده از HCl 1 مولار در 6/2 ثابت شد. عصاره تهیه‌شده به مدت 15 دقیقه در دمای ºC121 استریل و تا 24 ساعت پیش از تلقیح در دمای ºC4 نگهداری شد (28).
آماده‌سازی باکتریها به منظور تلقیح به محیطهای کشت
یک کلونی خالص به 10 میلی‌لیتر محیط BHI براث استریل منتقل شد و در انکوباتور شیکردار با دور rpm 200 انکوبه شد (29). باکتریها در جذب حدود 0/4 (OD600) معادل تقریباً 109 باکتری در هر میلی لیتر بودند. در این میزان جذب باکتریها تقریباً در اوایل تا اواسط مرحله رشد لگاریتمی است.
تلقیح باکتریها به محیطهای کشت
بدین منظور از باکتریها در جذب 0/4 با تعداد 109 باکتری در هر میلی لیتر استفاده شد. برای تهیه پلیت باکتری، محلول باکتریایی با دور rpm 7000 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. قبل از تلقیح به محیط های کشت مدنظر، با سه مرحله رقیق‌سازی 10/1، تعداد باکتریها به 106 در هر میلی‌لیتر رسید. برای این منظور 200 میکرولیتر از سوسپانسیون حاوی باکتری به 1800 میکرولیتر محیطهای NS، BHI براث و FB تلقیح شد. پس از تلقیح، از تیمار 3 نمونه به طور تصادفی برای تعیین تعداد اولیه باکتری روی محیط BHI آگار کشت داده شد.
شوک انجماد نمونه ها
هر تیمار با سه تکرار به ترتیب 4 و 8 ساعت و 2، 4، 8، 20، 30 و 60 روز پس از قرارگیری نمونهها در فریزر ºC18- تا رسیدن زمان موعد کلنی کانت و استخراج، قرار داده شدند.
شمارش کلنی
در انتهای زمان فریزکردن نمونهها، به منظور بررسی تعداد باکتری‌های کشت‌پذیر روی محیط BHI آگار غنی‌شده با 2 درصد عصاره مخمر و 5/0 درصد سدیم پیروات، شمارش کلنی انجام شد. در تمامی زمانهای فوق شمارش کلنی هر سه محیط پس از 24 و 48 ساعت بررسی و شمارش شد.
بررسی بیان ژن
بدین منظور ژن 16S rRNA به عنوان ژن خانه‌گردان (Houskeeping gene) همچنین ژنهای hly و inlA به عنوان ژنهای بیماریزایی این باکتری (30) برای مقایسه در دو محیط BHI و FB بررسی شدند. بررسی بیان این ژنها یک‌بار قبل از شوک و بار دیگر بعد از شوک انجماد طی روزهای 2 و 20 به منظور مقایسه بیان آنها انجام شد. برای بررسی بیان ژن به ترتیب زیر مراحل انجام شد:
استخراج RNA باکتری
بدین منظور از کیت استخراج شرکت سیناکلون، ایران استفاده شد که مراحل آن طبق برنامه به شرح زیر است:
1. تهیه رسوب باکتری ( min2-rpm 10000)؛ 2. افزودن lµ 40 آنزیم لیزوزیم mg 0/4 (min 20/ ºC37)؛ 3. افزودن µl 400 محلول لیز لایزیز بافر انکوبه‌شده؛ 4. افزودن µl 300 از محلول precipitation؛ 5. انتقال به ستون استخراج RNA (min 1-rpm 13000)؛ 6. افزودن lµ 400 محلول شست‌وشوی اول (min 1-rpm 13000)؛ 7. افزودن lµ 400 محلول شست‌وشوی دوم به تعداد 2 بار (min 1-rpm 13000)؛ 8. رفع اتانول احتمالی باقی‌مانده (min 2-rpm 13000)؛ 9. انتقال ستون ها به میکروتیوب جدید ml 5/1؛ 10. افزودن lµ 30 از محلول RNase free water انکوبه‌شده در دمای ºC55 به ستونها (min 1-rpm 13000) دو بار. RNA حاصل تا زمان استفاده در ºC70- نگهداری شد.
برای حذف DNA ناشی از آلودگی با استفاده از کیت DNase شرکت Genet Bio به شرح زیر استفاده شد:
به ازای هر gµ 1 RNA مقدار lµ 1 بافر MgCl2 و lµ 1 آنزیم DNase افزوده و مخلوط درºC37 به مدت 30 دقیقه انکوبه شد. در انتها مقدار lµ 1 EDTA به میکروتیوب افزوده و به مدت 10 دقیقه درºC65 به منظور توقف فعالیت آنزیم DNase انکوبه شد. RNA حاصل به منظور استفاده در RT PCR و سنتز cDNA استفاده شد.
سنتز cDNA
به منظور سنتز cDNA از کیت ABI استفاده شد. بدین منظور مستر ساخت cDNA با حجم lµ 10 که شامل موارد زیر است ساخته شد: RT Buffer(2 µl)، dntp(0.8 µl) ، Random Primer(2 µl)، RT(1)، DW(4.2 µl). درنهایت با µl 10 از RNA ترکیب شدند. برنامه دمایی ساخت cDNA به شرح زیر بود: 1. ºC25، 10 دقیقه؛ 2. ºC37، 120 دقیقه؛ 3. ºC85، 5 دقیقه. cDNA سنتزشده به منظور انجام فرایند PCR استفاده شد.
فرایند PCR
به منظور انجام عملیات PCR از کیت Prim Taq Premix (2X) شرکت Genet Bio با دستور تهیه مستر میکس به صورت زیر استفاده شد: Buffer (2.5 µl)، Mgcl2 (2 µl)، dntp (0.5 µl)، Taq (0.2 µl)، Primer Forward (0.5 µl (10 pm))، Primer Riverse (0.5 µl (10 pm))، DW (12.8 µl). میزان نمونه cDNA µl1 بود. مخلوط به مدت 10 ثانیه سانتریفیوژ جزئی شد تا قطراتی که روی جداره میکروتیوپ بود، حذف شود. سپس در دستگاه PCR با تنظیمات دمایی زیر قرار داده شد:
1. واسرشت اولیه 5 دقیقه در ºC95؛ 2. تکثیر DNA به تعداد 37 چرخه: الف) واسرشت 30 ثانیه در ºC94، ب) اتصال پرایمر: 40 ثانیه در ºC60، ج) گسترش: 40 ثانیه در ºC72؛ 3. باز سرشت نهایی 5 دقیقه در ºC72.
الکتروفورز محصول PCR با استفاده از ژل 2-1/5 درصد آگارز صورت پذیرفت و سپس از ژل با استفاده از دستگاه ژل داک عکس‌برداری شد. توالی پرایمرهای استفاده شده در جدول یک درج شده است.
کشت در محیط بلاد آگار
به منظور احیای احتمالی باکتری ها، در انتهای دوره انجماد از محیط آبگوشت ماهی بر روی محیط بلاد آگار کشت داده شد و به مدت 48-24 ساعت در دمای ºC37 انکوبه و همولیز بتای آن بررسی شد. سپس بیان هر سه ژن 16s rRNA، hly و inlA بررسی شد.
تجزیه و تحلیل آماری
این آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی انجام گرفت. نتایج دادههای پارامتریک با روش های ANOVA ارزیابی شد و مقایسه میانگینها با آزمون LSD صورت پذیرفت. برای تجزیه و تحلیل آماری داده های نرمال از آزمون دانکن و برای دادههای غیرنرمال از آزمون من ویتنی استفاده شد. در مواقع لزوم از آزمون ناپارامتریک کای اسکوور برای تجزیه و تحلیل داده های ناپارامتریک استفاده شد. تمام تجزیه و تحلیل‌ها در سطح اطمینان 5 درصد و با نرم افزار SPSS صورت پذیرفت. نتایج به‌دست‌آمده با ترسیم نمودارها با استفاده از نرم‌افزار اکسل انجام شد.
بررسی نتایج شمارش کلنی باکتری ها در محیط BHI آگار غنی‌شده
نتایج بررسی شمارش کلنی در محیط BHI آگار غنی‌شده در هر سه تیمار NS، BHI براث، FB طی زمانهای 4 و 8 ساعت و 2، 4، 8، 20، 30 و 60 روز پس از قرارگیری نمونه ها در فریزر، نشان داد این باکتری در شوک دمایی ºC18- قابلیت رشد روی محیط کشت غنی‌شده BHI آگار را حفظ کرده است، اما تعداد آنها طی این زمان با کاهش همراه بود (شکل 1).
نتایج بررسی بیان ژن
بررسی نتایج شمارش کلنی باکتریها در محیط BHI آگار غنی شده
نتایج بررسی بیان ژنهای 16s rRNA، hly و inlA قبل از شوک انجماد نشان‌دهنده بیان هر سه ژن و داشتن خاصیت بیماریزایی این باکتری بود (شکل 2).
نتایج الکتروفورز محصول PCR باکتریها پس از شوک انجماد برای روز دوم استخراج نشان‌دهنده بیان ژن 16S rRNA در هر دو تیمارBHI براث و FB بود. طبق این نتایج باکتری L. monocytogenes در دمای ºC18- به مدت 20 دقیقه قادر به زنده ماندن است و ژن خانه‌گردان خود را نیز بیان می‌کند. همچنین شاهد بیان ژن hly به ترتیب در تکرارهای دوم و اول محیطهای BHI و FB بودیم. ژن inlA در هیچ‌کدام از تیمارها بیان نشد (شکل 3).
شکل 2. نتایج الکتروفورز محصول PCR حاصل فرایند بررسی بیان ژن 16s rRNA، hly و inlA قبل از شوک انجماد
ترتیب و تکرار تیمارها برای هر دو محیط به ترتیب 1، 2 و 3؛ کنترل مثبت (C+) شامل DNA لیستریا مونوسیتوژنز؛ کنترل منفی (C-) شامل نمونه بدون الگو
شکل 3. نتایج الکتروفورز محصول PCR حاصل فرایند بررسی بیان ژن 16s rRNA، hly و inlA در تیمارهای BHI (BHI Broth) و FB (Fish Broth) در روز دوم انجماد ترتیب و تکرار تیمارها برای هر دو محیط به ترتیب 1، 2 و 3؛ کنترل مثبت (C+) شامل DNA لیستریا مونوسیتوژنز؛ کنترل منفی (C-) شامل نمونه بدون الگو
نتایج الکتروفورز برای روز بیستم استخراج نشان‌دهنده بیان ژن 16S rRNA در هر دو تیمار BHI براث و FB بود. ژن hly و ilnA در هیچ‌کدام از تیمارها بیان نشد (شکل 4).
از مقایسه نتایج بررسی بیان ژن با نتایج شمارش کلنی در محیط کشت غنی‌شده BHI آگار، میتوان به این نتیجه رسید باکتری موجود در هر سه محیط طی شوک انجماد زنده است و خاصیت بیماریزایی خود را از طریق بیان ژن hly در دو محیط شرایط مغذی (BHI ,FB) در روز دوم حفظ کرده است. از آنجا که در شمارش باکتریها در محیط کشت غنی شاهد رشد باکتریها بودیم، می توان نتیجه گرفت باکتری وارد فاز VBNC نشده است، اما بر اثر شوک دمایی وارده ضعیف شده است.
نتیجه بررسی کشت در بلاد آگار در انتهای دوره انجماد
نتایج نشان‌دهنده رشد باکتری تلقیح‌شده از محیط FB در روز شصتم و همولیز مثبت آن در محیط آگار خون‌دار بود.
نتایج بررسی بیان ژن محیط FB در محیط بلاد آگار
نتایج نشان‌دهنده بیان ژن 16S rRNA و بیان مجدد ژن hly بود. در مورد ژن inlA هیچ‌گونه بیانی مشاهده نشد (شکل 5).
L. monocytogenes به‌خوبی در شرایط انجماد زنده می‌ماند و نگهداری به صورت منجمد باعث ثابت ماندن تقریبی جمعیت زنده باکتری میشود (34). در پژوهش حاضر باکتری L. monocytogenes به انجماد مقاوم بود و با حفظ کشت‌پذیری‌اش تا انتهای دوره انجماد قادر به زنده ماندن بود. مطالعات نشان داده است L. monocytogenes میتواند در گوشت گوسفند در دمای ºC23- به مدت 20 روز، در ºC20- به مدت 2 سال با 35 بار انجمادزدایی و در کره در دمای ºC18- به مدت 70 روز زنده بماند (35). همچنین در مطالعهای دیگری بررسی وجود و بقای L. monocytogenes نشان داده است از میان 470 نمونه ماهی خام، محصولات ماهی و محصولات دریایی دیگر، 1/92 درصد از آنها به L. monocytogenes آلوده بودند؛ به این صورت که از بین 45 نمونه ماهی هیک منجمد یک مورد (2/22 درصد)، از بین 61 نمونه محصول دریایی منجمد 2 مورد و 4 مورد محصول ماهی منجمد، به باکتری آلوده بودند. آنها همچنین اشاره داشتند این باکتری میتواند ماهیان دریاهای گرمسیری را آلوده کند که از جمله محصولات آلوده شده از این طریق میتوان به آلودگی 17/2 درصد صدف منجمد و 12/1 درصد شل فیشهای[3] خوراکی منجمد اشاره کرد.
L. monocytogenes به عنوان جنس عفونت‌زای گونه Listeria در دومین رده دفعات جداسازی از نمونه ها قرار دارد که این مسئله نگران‌کننده است (36). طبق مطالعات باکتری L. monocytogenes به فریز کردن مقاوم است. طبیعت سرمادوست این باکتری همراه با کاهش طول زنجیره اسید چرب است (2). بقای باکتری در طول دوره انجماد به طور معمول به چندین عامل بستگی دارد، که شامل طبیعت سلول (37، 38)، ترکیب محافظ های سرمایی (37، 39) و شرایط انجماد-انجمادزدایی (37، 40) است. بقا پس از گرسنگی با فراهم‌سازی انرژی درونی از طریق مواد ذخیرهای، RNA و پروتئینهایی که فرایندهای سلولی را حفظ میکنند اتفاق می‌افتد. انجماد و انجمادزدایی لیستریا منجر به آسیب دیواره سلولی و غشای پلاسمایی می شود که ناشی از تشکیل کریستال‌های داخل و خارج سلولی میشود (2). دمای انجمادزدایی ممکن است از طریق تغییرات غلظت الکترولیت یا کریستاله‌شدن مجدد در طول انجمادزدایی به شکل جدی بر بقای باکتری تأثیر بگذارد (41-43).در تحقیق حاضر تعداد باکتریها ثابت نماند و نتایج کلنی کانت و نمودار رشد باکتری نشان داد تعداد آنها تا انتهای دوره انجماد کاهش یافته و از cfu/g 107 به cfu/g 105 رسیده است. سلولهای باکتریایی همچنان قابل کشت بود. در راستای نتایج ما هریسون و همکاران (1991) مشاهده کردند تعداد سلولهای L. monocytogenes تلقیح‌شده به ماهی و میگو پس از انجماد در دمای C° 20- به مدت سه ماه، به اندازه log 3 کاهش می‌یابد (44). طبق مطالعات، pH کم محیطهای منجمد، مرگ و صدمه سلولهای L. monocytogenes را طی نگهداری منجمد افزایش میدهد (45). از این‌رو یکی از عوامل کاهش تعداد باکتریها در این تحقیق را میتوان در pH محیط جست‌وجو کرد. همچنین کاهش تعداد باکتریها را میتوان یا به دلیل آسیب سلولی و مرگ آن عنوان کرد، هرچند که احتمال آن کم است چون انجماد منجر به مرگ باکتری نمی‌شود، و یا به دلیل ورود به حالت VBNC. زمان بیشتری برای بررسی نتایج کلنی کانت لازم بود تا مشخص شود باکتریها وارد حالت VBNC میشوند یا نه.
انواع مختلفی از باکتریها میتوانند در دمای کم محیطی وارد حالت VBNC شوند؛ مانند ویبریو (21)، آئروموناس (46)، یرسینیا (47)، سالمونلا (48) و اخیرا لیستریا (49). در پژوهش حاضر باکتری L. monocytogenes تا انتهای دوره انجماد در هر دو محیط وارد حالت VBNC نشد. در این زمینه تحقیقات بسیار کمی انجام شده است؛ از جمله آنها پژوهش Zeng و همکاران (2013) است که نشان داد باکتری Salmonella typhi پس از 48 ساعت نگهداری در دمای ºC20- در شرایط گرسنگی وارد حالت VBNC میشود و پس از احیا، در موش خاصیت بیماریزایی خواهد داشت (48).
همچنین بررسی بیان ژنهای بیماریزایی hly و inlA نشان داد بیان ژن hly با افزایش زمان متوقف میشود. درنتیجه باکتری تا انتهای دوره انجماد قادر به حفظ خاصیت بیماریزایی‌اش نبود. دما برای بیان ژنهای اصلی بیماریزایی در L. monocytogenes مهم است (50). در این ارتباط Duodu و همکاران (2010) عنوان کرده اند بیان ژنهای بیماریزای L. monocytogenes زمانی که فیله ماهی سالمون در دماهای مختلف نگهداری شود، به صورت متفاوتی بیان میشود. بیان ژنهای hly و ilnA در دمای ºC20 بیش از دماهای 0 و ºC4 است (51). در نتیجه میتوان عنوان کرد در دمای کم، بیان ژنها کاهش می یابد که دلیل آن میتواند نرخ متابولیکی کم باکتری در دماهای کم باشد. همان‌طور که در نتایج عنوان شده است، به منظور احیای احتمالی باکتری های صدمه‌دیده یا آنهایی که احتمالاً وارد حالت VBNC شده اند، در ماتریکس گوشت ماهی از محیط غنی‌شده حاوی سدیم پیروات و مخمر استفاده شد. مطالعه حاضر نشان داد ژنهای hly و inlA در باکتری های رشد یافته بیان نمی‌شوند یا اصطلاحاً خاموش بودند، اما زمانی که خون به محیط کشت باکتری ها افزوده شد، ژن hly که مسئول همولیز سلولهاست مجدداً روشن شد و همولیز بتای باکتری نیز در محیط کشت مثبت شد، در صورتی که ژن inlA همچنان خاموش ماند. این موضوع نشان می دهد خون حاوی عواملی است که میتواند روشن‌شدن ژن بیماریزای hly را در این باکتری القا کند. اولین گزارش در مورد احیای سلولهای VBNC پس از تیمار سلولهای سالمونلا تیفی با مواد مغذی (تزریق BHI) مشاهده شد. طبق این گزارش پس از 4 روز از ورود سلول‌ها به حالت VBNC، احیا اتفاق افتاد (52). در ارتباط با بیان ژن hly، Bunic و همکاران (1996) مشخص کرده اند فعالیت لیستریولیزین O پس از چندین هفته ماندن باکتری L. monocytogenes در دمای کم از دست می رود و خاصیت بیماریزایی آن پس از 24 ساعت انکوبه در دمای ºC37 بازمیگردد (53) که دلیل آن را میتوان به پروتئین PrfA که تنظیم‌کننده بیان ژنهای بیماریزای hly، inlA و actA است، نسبت داد که به دما وابسته است و در دمای زیر ºC30 بیان نمی شود (53). بیان این ژنها توسط Sigma-B نیز کنترل میشود که بیان این ژن ممکن است استرسهای فیزیولوژیکال در میکروارگانیسم را بهبود بخشد (53 -55)، همچنین فعالیت Sigma-B به مرحله رشد باکتری بستگی دارد که حداکثر فعالیت آن در فاز سکون باکتری است (56، 57). pH بهینه لیستریولیزین O 5/5 است و در7 pH: غیرفعال بود. فعالیت آنها دوباره با کاهش pH به 5/5 احیا شد (58). عدم بیان ژن inlA را میتوان در دسترس‌نبودن شرایط مغذی مورد نیاز برای روشن‌شدن آن بیان کرد.
مطالعات در ارتباط با باکتریهایی که تحت تنشهای مختلف فرآوری محصولات آماده مصرف قرار میگیرند و ممکن است تحت این شرایط وارد حالت VBNC شوند، نقش مهمی در برنامهریزی سلامت انسانها و حیوانات به عهده دارد. به دلیل اینکه این سلول‌ها ممکن است با یا بدون ورود به حالت VBNC خاصیت بیماریزایی خود را حفظ کنند و با مصرف محصول آماده مصرف، منجر به بیماری در مصرف‌کننده شوند و یا اینکه بیان ژنهای بیماریزا در بدن مصرف‌کننده از سر گرفته شود و منجر به مسمومیت یا مرگ مصرف‌کننده شود. درک بیشتر سلولهای VBNC ممکن است به ما در توضیح اینکه چرا شمار باکتریایی در زمستان کاهش می‌یابد، کمک کند.
در تحقیق حاضر مشاهده شد که طی دوره انجماد از تعداد باکتری های اولیه کاسته شد و بیان ژن خانه گردان 16S rRNA تا انتهای دوره ادامه داشت، اما با گذشت زمان بیان ژنهای بیماریزا متوقف شد، در عین حال خاصیت بیماریزایی با کشت در محیط بلاد آگار مجددا حاصل شد. همچنین ممکن است باکتری با ورود به بدن و قرارگرفتن در معرض شرایط مناسب رشدی، مجدداً خاصیت بیماریزایی‌اش را به دست آورد و موجب مسمومیت و مرگ مصرف‌کننده شود. این موضوع میتواند هشداری جدی برای تولیدکنندگان محصولات منجمد در ارتباط با بیماریزایی این پاتوژن برای مصرف‌کننده باشد. بنابراین بازبینی فرایند فرآوری محصولات شیلاتی و اخذ فرایندهای فرآوری بهتر قبل از مصرف توصیه می شود.
از تمام کسانی که ما را در انجام این پژوهش یاری کردند، به‌ویژه مسئولان محترم آزمایشگاه‌های گروه میکروبیولوژی دانشکده پزشکی و گروه بیوتکنولوژی دانشگاه علوم پزشکی گلستان کمال تشکر و قدردانی را داریم.
نویسندگان هیچ‌گونه تعارض منافعی ندارند.
متن کامل: (3542 مشاهده)
مقدمه
Listeria monocytogenes گروهی از باکتری‌های گرم مثبت، میله‌ای‌شکل، بدون اسپور، کاتالاز مثبت و اکسیداز منفی هستند (1). فرم بدون اسپور این باکتری به فریزکردن و خشک‌کردن مقاوم است. لیستریا میتواند درجه حرارت کم (ºC0/4-) و بازۀ گستردهای از pH (3/6 تا 9/6) و همچنین فعالیت آبی (aw) نسبتاً کم و غلظت زیاد نمک (10 درصد<) را تحمل کند (2). نگرانی رو به رشد در دهه های گذشته ورود L. monocytogenes به غذاها بوده است (3). این پاتوژن منجر به بیماری لیستریوزیس میشود؛ یک بیماری نادر اما جدی، به‌ویژه برای گروه در خطر (3) که غالباً شامل بزرگسالان دچار نقص ایمنی، افراد مسن، نوزادان تازه متولدشده و زنان باردار هستند و همراه با سقط جنین، مردهزایی، سپتی‌سمی و مننژیت است (4). در سال 2007 در اتحادیه اروپا 0/3 مورد در هر 100هزار مورد با نرخ مرگ‌ومیر 20 درصد ناشی از لیستریوزیس گزارش شده است (3).
موارد متعددی از شیوع لیستریوزیس در اثر مصرف غذاهای دریایی گزارش شده است (5). برخی از کشورها حد مجاز صفر را برای L. monocytogenes در ماهی های وارداتی در نظر گرفته اند. بنابراین تقاضای تولیدکنندگان محصولات دریایی برای مواد خام عاری از L. monocytogenes در طول فرآوری محصولات دریایی اهمیت قابل توجهی دارد (6). L. monocytogenes از محصولات دریایی مثل ماهی دودی، محصولات دریایی پخته و منجمد، ترشی ماهی و سوریمی جداسازی شده است (7). با اینکه 13 سروتیپ از سویه L. monocytogenes شناسایی شده اند، اغلب موارد انسانی شامل سروتی پهای 1.2a، 1.2b و 4b است (8-10) سروتیپ 4b مسئول شیوع بسیاری از موارد لیستریوزیس با منشأ غذایی است (9). این پاتوژن تحت شرایط استرس زای مختلف از جمله انکوباسیون خارج از دمای بهینه رشد، شوری زیاد، افزایش فشار اسمزی، غلظت اکسیژن، نور مرئی، گرسنگی و فرایندهایی که تصور می شود منجر به نابودی باکتری می شود، وارد حالت «زنده اما غیرقابل کشت»[1] می شود (11-15). این تعریف برای حالتی است که باکتری به دلیل حفظ فعالیت متابولیکی زنده است، اما قابلیت کشت و رشد را ندارد. بنابراین کلنیها را در محیطهای اختصاصی کشت معمول توسعه نمی دهد (6). به نظر میرسد عوامل بیماریزایی شامل actA، hly، iap، inlA وplcA نقش ویژه‌ای در بیماریزایی L. monocytogenes دارند (16-20). hly کدکننده لیستریولیزین O است که برای لیز حفره مانند و ورود به سیتوزول سلول ضروری است (17). ژن inlA عملکرد مهمی در تهاجم باکتری با مکانیسم انتروسیتوز[2] دارد (19).
از آنجایی که لیستریولایزین O (hly) عامل بیماریزای مهمی در L. monocytogenes است، بیان ژن hly در فاز VBNC نشان‌دهنده توانایی بیماریزایی باکتری در این فاز VBNC است (11-22). در این راستا توانایی ورود L. monocytogenes جداشده از سالمون خام، محیط فرآوری این ماهی و بیماران مبتلا به لیستریوزیس، به فاز VBNCو نیز بیماریزایی آن ارزیابی و بررسی شده است. این ارزیابی‌ها نشان داده است همه سویه ها پس از گرسنگی وارد فازVBNC میشوند و در حضور سدیم پیروات و تغذیه با مواد غذایی جایگزین احیاء نمی شوند (23). همچنین این مطالعات نشان داده است همزمان با از دست‌رفتن قابلیت کشت، خاصیت بیماریزایی نیز از دست می رود. همچنین عنوان شده است سویه های L. monocytogenes ممکن است در محیط آبی برای دوره های طولانی تری در فاز VBNC بمانند، اما این سلول‌ها بیماریزا نیستند (24). انجماد محصول فرآوری‌‌شده روشی مناسب برای جلوگیری از رشد L. monocytogenes است. هر چند L. monocytogenes (در صورت وجود) در محصول نهایی یا فرآوری‌‌شده با انجماد از بین نمی رود، اما رشد آن طی دوره انجماد متوقف خواهد شد. انجماد و ذخیره طولانی مدت به شکل منجمد میتواند تأثیراتی منفی روی خواص محصول بگذارد. همچنین، با وجود نگهداری محصول فرآوری‌‌شده در فریزر به صورت طولانی مدت، انجمادزدایی میتواند منجر به رشد L. monocytogenes در محصول فرآوری‌‌شده شود (25). پس از انجماد گونههای مختلف، انواع متفاوتی از بقا را در ارتباط با اندازه سلول و شکل و ساختار آن نشان دادهاند. باکتریهایی با اندازه بزرگ‌تر و پیچیدگی بیشتر در مقابل آسیبهای انجماد نسبت به انواع کوچک‌تر و سادهتر مقاومت کمتری دارند (26، 27). توانایی ورود L. monocytogenes به فاز VBNC طی استرسهای حین فرآوری نگران‌کننده است؛ به دلیل آنکه آزمونهای باکتریولوژیکی کشت معمول، موفق به شناسایی ارگانیسمهای غیرقابل کشت در محصول و محیط فرآوری نشده و ریسک خطر مصرف لیستریا مونوسیتوژنز در فاز VBNC هنوز ناشناخته است. یکی از این استرسها انجماد است. به همین دلیل هدف از این مطالعه بررسی امکان ورود L. monocytogenes به حالت VBNC طی انجماد ºC18- با استفاده از بررسی بیان ژن 16S rRNA و بررسی بیماریزایی آن با استفاده از ژنهای hly و inlA است.
مواد و روش‌ها
باکتری L. monocytogenes سویه استاندارد ATCC 19115 (سروتیپ 4b)، از سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران در سال 1397 به صورت لیوفیلیزه تهیه شد. باکتریها در محیط BHI براث به مدت 24 ساعت در ºC37 انکوبه شدند. سپس روی محیط BHI آگار کشت شدند و 24 ساعت در ºC37 انکوبه و یک کلونی خالص از آن برای ادامه مطالعات استفاده شد.
محیطهای بررسی‌شده
امکان ورود باکتری L. monocytogenes به حالت VBNC در دمای انجماد ºC18- در سه محیط سرم فیزیولوژی (NS)Normal saline (به عنوان شرایط نبود مواد تغذیه‌ای و ماتریکس محافظت‌کننده) BHI براث (شرایط محیط تغذیه‌ای غنی) و آبگوشت ماهی یا Fish Broth (FB) (شرایط ماتریکس گوشت ماهی) قزل‌آلای رنگین‌کمان (Oncorhynchus mykiss) بررسی شد. محیط BHI براث طبق برنامه شرکت مربوطه آماده‌سازی و اتوکلاو شد.
آماده‌سازی محیط آبگوشت ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان (FB)
عصاره ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان به روش Nilsson و همکاران (1999) آماده شد. در این روش ابتدا ماهی قزل‌آلا تمیز (پوست‌کنی و تخلیه امعا و احشا) و چرخ شد. در ادامه با آب مقطر به نسبت 1:2 (وزنی/حجمی) به مدت 10 دقیقه جوشانده و به مدت 10 دقیقه فیلتر شد. عصاره حاصل با افزودن 5/98 گرم در لیتر KH2PO4 و 9/75 گرم در لیتر K2HPO4 بافری و pH آن با استفاده از HCl 1 مولار در 6/2 ثابت شد. عصاره تهیه‌شده به مدت 15 دقیقه در دمای ºC121 استریل و تا 24 ساعت پیش از تلقیح در دمای ºC4 نگهداری شد (28).
آماده‌سازی باکتریها به منظور تلقیح به محیطهای کشت
یک کلونی خالص به 10 میلی‌لیتر محیط BHI براث استریل منتقل شد و در انکوباتور شیکردار با دور rpm 200 انکوبه شد (29). باکتریها در جذب حدود 0/4 (OD600) معادل تقریباً 109 باکتری در هر میلی لیتر بودند. در این میزان جذب باکتریها تقریباً در اوایل تا اواسط مرحله رشد لگاریتمی است.
تلقیح باکتریها به محیطهای کشت
بدین منظور از باکتریها در جذب 0/4 با تعداد 109 باکتری در هر میلی لیتر استفاده شد. برای تهیه پلیت باکتری، محلول باکتریایی با دور rpm 7000 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. قبل از تلقیح به محیط های کشت مدنظر، با سه مرحله رقیق‌سازی 10/1، تعداد باکتریها به 106 در هر میلی‌لیتر رسید. برای این منظور 200 میکرولیتر از سوسپانسیون حاوی باکتری به 1800 میکرولیتر محیطهای NS، BHI براث و FB تلقیح شد. پس از تلقیح، از تیمار 3 نمونه به طور تصادفی برای تعیین تعداد اولیه باکتری روی محیط BHI آگار کشت داده شد.
شوک انجماد نمونه ها
هر تیمار با سه تکرار به ترتیب 4 و 8 ساعت و 2، 4، 8، 20، 30 و 60 روز پس از قرارگیری نمونهها در فریزر ºC18- تا رسیدن زمان موعد کلنی کانت و استخراج، قرار داده شدند.
شمارش کلنی
در انتهای زمان فریزکردن نمونهها، به منظور بررسی تعداد باکتری‌های کشت‌پذیر روی محیط BHI آگار غنی‌شده با 2 درصد عصاره مخمر و 5/0 درصد سدیم پیروات، شمارش کلنی انجام شد. در تمامی زمانهای فوق شمارش کلنی هر سه محیط پس از 24 و 48 ساعت بررسی و شمارش شد.
بررسی بیان ژن
بدین منظور ژن 16S rRNA به عنوان ژن خانه‌گردان (Houskeeping gene) همچنین ژنهای hly و inlA به عنوان ژنهای بیماریزایی این باکتری (30) برای مقایسه در دو محیط BHI و FB بررسی شدند. بررسی بیان این ژنها یک‌بار قبل از شوک و بار دیگر بعد از شوک انجماد طی روزهای 2 و 20 به منظور مقایسه بیان آنها انجام شد. برای بررسی بیان ژن به ترتیب زیر مراحل انجام شد:
استخراج RNA باکتری
بدین منظور از کیت استخراج شرکت سیناکلون، ایران استفاده شد که مراحل آن طبق برنامه به شرح زیر است:
1. تهیه رسوب باکتری ( min2-rpm 10000)؛ 2. افزودن lµ 40 آنزیم لیزوزیم mg 0/4 (min 20/ ºC37)؛ 3. افزودن µl 400 محلول لیز لایزیز بافر انکوبه‌شده؛ 4. افزودن µl 300 از محلول precipitation؛ 5. انتقال به ستون استخراج RNA (min 1-rpm 13000)؛ 6. افزودن lµ 400 محلول شست‌وشوی اول (min 1-rpm 13000)؛ 7. افزودن lµ 400 محلول شست‌وشوی دوم به تعداد 2 بار (min 1-rpm 13000)؛ 8. رفع اتانول احتمالی باقی‌مانده (min 2-rpm 13000)؛ 9. انتقال ستون ها به میکروتیوب جدید ml 5/1؛ 10. افزودن lµ 30 از محلول RNase free water انکوبه‌شده در دمای ºC55 به ستونها (min 1-rpm 13000) دو بار. RNA حاصل تا زمان استفاده در ºC70- نگهداری شد.
برای حذف DNA ناشی از آلودگی با استفاده از کیت DNase شرکت Genet Bio به شرح زیر استفاده شد:
به ازای هر gµ 1 RNA مقدار lµ 1 بافر MgCl2 و lµ 1 آنزیم DNase افزوده و مخلوط درºC37 به مدت 30 دقیقه انکوبه شد. در انتها مقدار lµ 1 EDTA به میکروتیوب افزوده و به مدت 10 دقیقه درºC65 به منظور توقف فعالیت آنزیم DNase انکوبه شد. RNA حاصل به منظور استفاده در RT PCR و سنتز cDNA استفاده شد.
سنتز cDNA
به منظور سنتز cDNA از کیت ABI استفاده شد. بدین منظور مستر ساخت cDNA با حجم lµ 10 که شامل موارد زیر است ساخته شد: RT Buffer(2 µl)، dntp(0.8 µl) ، Random Primer(2 µl)، RT(1)، DW(4.2 µl). درنهایت با µl 10 از RNA ترکیب شدند. برنامه دمایی ساخت cDNA به شرح زیر بود: 1. ºC25، 10 دقیقه؛ 2. ºC37، 120 دقیقه؛ 3. ºC85، 5 دقیقه. cDNA سنتزشده به منظور انجام فرایند PCR استفاده شد.
فرایند PCR
به منظور انجام عملیات PCR از کیت Prim Taq Premix (2X) شرکت Genet Bio با دستور تهیه مستر میکس به صورت زیر استفاده شد: Buffer (2.5 µl)، Mgcl2 (2 µl)، dntp (0.5 µl)، Taq (0.2 µl)، Primer Forward (0.5 µl (10 pm))، Primer Riverse (0.5 µl (10 pm))، DW (12.8 µl). میزان نمونه cDNA µl1 بود. مخلوط به مدت 10 ثانیه سانتریفیوژ جزئی شد تا قطراتی که روی جداره میکروتیوپ بود، حذف شود. سپس در دستگاه PCR با تنظیمات دمایی زیر قرار داده شد:
1. واسرشت اولیه 5 دقیقه در ºC95؛ 2. تکثیر DNA به تعداد 37 چرخه: الف) واسرشت 30 ثانیه در ºC94، ب) اتصال پرایمر: 40 ثانیه در ºC60، ج) گسترش: 40 ثانیه در ºC72؛ 3. باز سرشت نهایی 5 دقیقه در ºC72.
الکتروفورز محصول PCR با استفاده از ژل 2-1/5 درصد آگارز صورت پذیرفت و سپس از ژل با استفاده از دستگاه ژل داک عکس‌برداری شد. توالی پرایمرهای استفاده شده در جدول یک درج شده است.
کشت در محیط بلاد آگار
به منظور احیای احتمالی باکتری ها، در انتهای دوره انجماد از محیط آبگوشت ماهی بر روی محیط بلاد آگار کشت داده شد و به مدت 48-24 ساعت در دمای ºC37 انکوبه و همولیز بتای آن بررسی شد. سپس بیان هر سه ژن 16s rRNA، hly و inlA بررسی شد.
تجزیه و تحلیل آماری
این آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی انجام گرفت. نتایج دادههای پارامتریک با روش های ANOVA ارزیابی شد و مقایسه میانگینها با آزمون LSD صورت پذیرفت. برای تجزیه و تحلیل آماری داده های نرمال از آزمون دانکن و برای دادههای غیرنرمال از آزمون من ویتنی استفاده شد. در مواقع لزوم از آزمون ناپارامتریک کای اسکوور برای تجزیه و تحلیل داده های ناپارامتریک استفاده شد. تمام تجزیه و تحلیل‌ها در سطح اطمینان 5 درصد و با نرم افزار SPSS صورت پذیرفت. نتایج به‌دست‌آمده با ترسیم نمودارها با استفاده از نرم‌افزار اکسل انجام شد.
جدول 1. توالی پرایمرهای استفاده‌شده در پژوهش (31-33)
| اندازه محصول (bp ) |
دمای اتصال (ºC) |
توالی الیگونوکلئوتید | نام ژن |
| 109 | 60 | F: TTA GCT AGT TGG TAG GGT R: AAT CCG GAC AAC GCT TGC |
16S rRNA |
| 139 | 60 | F: CGCAACAAACTGAAGCAAAGG R: TTGGCGGCACATTTGTCAC |
hly |
| 95 | 60 | F: CGGATGCAGGAGAAAATCC R: CTTTCACACTATCCTCTCC |
inlA |
یافته‌ها
بررسی نتایج شمارش کلنی باکتری ها در محیط BHI آگار غنی‌شده
نتایج بررسی شمارش کلنی در محیط BHI آگار غنی‌شده در هر سه تیمار NS، BHI براث، FB طی زمانهای 4 و 8 ساعت و 2، 4، 8، 20، 30 و 60 روز پس از قرارگیری نمونه ها در فریزر، نشان داد این باکتری در شوک دمایی ºC18- قابلیت رشد روی محیط کشت غنی‌شده BHI آگار را حفظ کرده است، اما تعداد آنها طی این زمان با کاهش همراه بود (شکل 1).
شکل 1. نتایج روند کلنی کانت باکتری L.monocytogenes در دمای ºC18- در در تیمارهای BHI (BHI Broth) و FB (Fish Broth)
محور افقی: مدت زمان سپری‌شده (دو زمان اول 4 ساعت و 8 ساعت پس از شوک مربوط به روز اول و زمانهای بعدی در روزهای بعدی)؛ محور عمودی: لگاریتم تعداد باکتری
محور افقی: مدت زمان سپری‌شده (دو زمان اول 4 ساعت و 8 ساعت پس از شوک مربوط به روز اول و زمانهای بعدی در روزهای بعدی)؛ محور عمودی: لگاریتم تعداد باکتری
نتایج بررسی بیان ژن
بررسی نتایج شمارش کلنی باکتریها در محیط BHI آگار غنی شده
نتایج بررسی بیان ژنهای 16s rRNA، hly و inlA قبل از شوک انجماد نشان‌دهنده بیان هر سه ژن و داشتن خاصیت بیماریزایی این باکتری بود (شکل 2).
نتایج الکتروفورز محصول PCR باکتریها پس از شوک انجماد برای روز دوم استخراج نشان‌دهنده بیان ژن 16S rRNA در هر دو تیمارBHI براث و FB بود. طبق این نتایج باکتری L. monocytogenes در دمای ºC18- به مدت 20 دقیقه قادر به زنده ماندن است و ژن خانه‌گردان خود را نیز بیان می‌کند. همچنین شاهد بیان ژن hly به ترتیب در تکرارهای دوم و اول محیطهای BHI و FB بودیم. ژن inlA در هیچ‌کدام از تیمارها بیان نشد (شکل 3).
شکل 2. نتایج الکتروفورز محصول PCR حاصل فرایند بررسی بیان ژن 16s rRNA، hly و inlA قبل از شوک انجماد
ترتیب و تکرار تیمارها برای هر دو محیط به ترتیب 1، 2 و 3؛ کنترل مثبت (C+) شامل DNA لیستریا مونوسیتوژنز؛ کنترل منفی (C-) شامل نمونه بدون الگو
شکل 3. نتایج الکتروفورز محصول PCR حاصل فرایند بررسی بیان ژن 16s rRNA، hly و inlA در تیمارهای BHI (BHI Broth) و FB (Fish Broth) در روز دوم انجماد ترتیب و تکرار تیمارها برای هر دو محیط به ترتیب 1، 2 و 3؛ کنترل مثبت (C+) شامل DNA لیستریا مونوسیتوژنز؛ کنترل منفی (C-) شامل نمونه بدون الگو
شکل 4. نتایج الکتروفورز محصول PCR حاصل فرایند بررسی بیان ژن 16s rRNA، hly و inlA در تیمارهای BHI (BHI Broth) و FB (Fish Broth) در روز بیستم انجماد ترتیب و تکرار تیمارها برای هر سه محیط به ترتیب 1، 2 و 3؛ کنترل مثبت (C+) شامل DNA لیستریا مونوسیتوژنز؛ کنترل منفی (C-) شامل نمونه بدون نمونه
نتایج الکتروفورز برای روز بیستم استخراج نشان‌دهنده بیان ژن 16S rRNA در هر دو تیمار BHI براث و FB بود. ژن hly و ilnA در هیچ‌کدام از تیمارها بیان نشد (شکل 4).
از مقایسه نتایج بررسی بیان ژن با نتایج شمارش کلنی در محیط کشت غنی‌شده BHI آگار، میتوان به این نتیجه رسید باکتری موجود در هر سه محیط طی شوک انجماد زنده است و خاصیت بیماریزایی خود را از طریق بیان ژن hly در دو محیط شرایط مغذی (BHI ,FB) در روز دوم حفظ کرده است. از آنجا که در شمارش باکتریها در محیط کشت غنی شاهد رشد باکتریها بودیم، می توان نتیجه گرفت باکتری وارد فاز VBNC نشده است، اما بر اثر شوک دمایی وارده ضعیف شده است.
نتیجه بررسی کشت در بلاد آگار در انتهای دوره انجماد
نتایج نشان‌دهنده رشد باکتری تلقیح‌شده از محیط FB در روز شصتم و همولیز مثبت آن در محیط آگار خون‌دار بود.
نتایج بررسی بیان ژن محیط FB در محیط بلاد آگار
نتایج نشان‌دهنده بیان ژن 16S rRNA و بیان مجدد ژن hly بود. در مورد ژن inlA هیچ‌گونه بیانی مشاهده نشد (شکل 5).
شکل 5. نتایج الکتروفورز محصول PCR حاصل فرایند بررسی بیان ژن 16s rRNA، hly و inlA در تیمار FB (Fish Broth) در روز شصتم انجماد، پس از احیا در محیط کشت بلاد آگار ترتیب و تکرار تیمارها برای هر دو محیط به ترتیب 1، 2 و 3؛ کنترل مثبت (C+) شامل DNA لیستریا مونوسیتوژنز؛ کنترل منفی (C-) شامل نمونه بدون نمونه
بحث و نتیجه‌گیری
L. monocytogenes به‌خوبی در شرایط انجماد زنده می‌ماند و نگهداری به صورت منجمد باعث ثابت ماندن تقریبی جمعیت زنده باکتری میشود (34). در پژوهش حاضر باکتری L. monocytogenes به انجماد مقاوم بود و با حفظ کشت‌پذیری‌اش تا انتهای دوره انجماد قادر به زنده ماندن بود. مطالعات نشان داده است L. monocytogenes میتواند در گوشت گوسفند در دمای ºC23- به مدت 20 روز، در ºC20- به مدت 2 سال با 35 بار انجمادزدایی و در کره در دمای ºC18- به مدت 70 روز زنده بماند (35). همچنین در مطالعهای دیگری بررسی وجود و بقای L. monocytogenes نشان داده است از میان 470 نمونه ماهی خام، محصولات ماهی و محصولات دریایی دیگر، 1/92 درصد از آنها به L. monocytogenes آلوده بودند؛ به این صورت که از بین 45 نمونه ماهی هیک منجمد یک مورد (2/22 درصد)، از بین 61 نمونه محصول دریایی منجمد 2 مورد و 4 مورد محصول ماهی منجمد، به باکتری آلوده بودند. آنها همچنین اشاره داشتند این باکتری میتواند ماهیان دریاهای گرمسیری را آلوده کند که از جمله محصولات آلوده شده از این طریق میتوان به آلودگی 17/2 درصد صدف منجمد و 12/1 درصد شل فیشهای[3] خوراکی منجمد اشاره کرد.
L. monocytogenes به عنوان جنس عفونت‌زای گونه Listeria در دومین رده دفعات جداسازی از نمونه ها قرار دارد که این مسئله نگران‌کننده است (36). طبق مطالعات باکتری L. monocytogenes به فریز کردن مقاوم است. طبیعت سرمادوست این باکتری همراه با کاهش طول زنجیره اسید چرب است (2). بقای باکتری در طول دوره انجماد به طور معمول به چندین عامل بستگی دارد، که شامل طبیعت سلول (37، 38)، ترکیب محافظ های سرمایی (37، 39) و شرایط انجماد-انجمادزدایی (37، 40) است. بقا پس از گرسنگی با فراهم‌سازی انرژی درونی از طریق مواد ذخیرهای، RNA و پروتئینهایی که فرایندهای سلولی را حفظ میکنند اتفاق می‌افتد. انجماد و انجمادزدایی لیستریا منجر به آسیب دیواره سلولی و غشای پلاسمایی می شود که ناشی از تشکیل کریستال‌های داخل و خارج سلولی میشود (2). دمای انجمادزدایی ممکن است از طریق تغییرات غلظت الکترولیت یا کریستاله‌شدن مجدد در طول انجمادزدایی به شکل جدی بر بقای باکتری تأثیر بگذارد (41-43).در تحقیق حاضر تعداد باکتریها ثابت نماند و نتایج کلنی کانت و نمودار رشد باکتری نشان داد تعداد آنها تا انتهای دوره انجماد کاهش یافته و از cfu/g 107 به cfu/g 105 رسیده است. سلولهای باکتریایی همچنان قابل کشت بود. در راستای نتایج ما هریسون و همکاران (1991) مشاهده کردند تعداد سلولهای L. monocytogenes تلقیح‌شده به ماهی و میگو پس از انجماد در دمای C° 20- به مدت سه ماه، به اندازه log 3 کاهش می‌یابد (44). طبق مطالعات، pH کم محیطهای منجمد، مرگ و صدمه سلولهای L. monocytogenes را طی نگهداری منجمد افزایش میدهد (45). از این‌رو یکی از عوامل کاهش تعداد باکتریها در این تحقیق را میتوان در pH محیط جست‌وجو کرد. همچنین کاهش تعداد باکتریها را میتوان یا به دلیل آسیب سلولی و مرگ آن عنوان کرد، هرچند که احتمال آن کم است چون انجماد منجر به مرگ باکتری نمی‌شود، و یا به دلیل ورود به حالت VBNC. زمان بیشتری برای بررسی نتایج کلنی کانت لازم بود تا مشخص شود باکتریها وارد حالت VBNC میشوند یا نه.
انواع مختلفی از باکتریها میتوانند در دمای کم محیطی وارد حالت VBNC شوند؛ مانند ویبریو (21)، آئروموناس (46)، یرسینیا (47)، سالمونلا (48) و اخیرا لیستریا (49). در پژوهش حاضر باکتری L. monocytogenes تا انتهای دوره انجماد در هر دو محیط وارد حالت VBNC نشد. در این زمینه تحقیقات بسیار کمی انجام شده است؛ از جمله آنها پژوهش Zeng و همکاران (2013) است که نشان داد باکتری Salmonella typhi پس از 48 ساعت نگهداری در دمای ºC20- در شرایط گرسنگی وارد حالت VBNC میشود و پس از احیا، در موش خاصیت بیماریزایی خواهد داشت (48).
همچنین بررسی بیان ژنهای بیماریزایی hly و inlA نشان داد بیان ژن hly با افزایش زمان متوقف میشود. درنتیجه باکتری تا انتهای دوره انجماد قادر به حفظ خاصیت بیماریزایی‌اش نبود. دما برای بیان ژنهای اصلی بیماریزایی در L. monocytogenes مهم است (50). در این ارتباط Duodu و همکاران (2010) عنوان کرده اند بیان ژنهای بیماریزای L. monocytogenes زمانی که فیله ماهی سالمون در دماهای مختلف نگهداری شود، به صورت متفاوتی بیان میشود. بیان ژنهای hly و ilnA در دمای ºC20 بیش از دماهای 0 و ºC4 است (51). در نتیجه میتوان عنوان کرد در دمای کم، بیان ژنها کاهش می یابد که دلیل آن میتواند نرخ متابولیکی کم باکتری در دماهای کم باشد. همان‌طور که در نتایج عنوان شده است، به منظور احیای احتمالی باکتری های صدمه‌دیده یا آنهایی که احتمالاً وارد حالت VBNC شده اند، در ماتریکس گوشت ماهی از محیط غنی‌شده حاوی سدیم پیروات و مخمر استفاده شد. مطالعه حاضر نشان داد ژنهای hly و inlA در باکتری های رشد یافته بیان نمی‌شوند یا اصطلاحاً خاموش بودند، اما زمانی که خون به محیط کشت باکتری ها افزوده شد، ژن hly که مسئول همولیز سلولهاست مجدداً روشن شد و همولیز بتای باکتری نیز در محیط کشت مثبت شد، در صورتی که ژن inlA همچنان خاموش ماند. این موضوع نشان می دهد خون حاوی عواملی است که میتواند روشن‌شدن ژن بیماریزای hly را در این باکتری القا کند. اولین گزارش در مورد احیای سلولهای VBNC پس از تیمار سلولهای سالمونلا تیفی با مواد مغذی (تزریق BHI) مشاهده شد. طبق این گزارش پس از 4 روز از ورود سلول‌ها به حالت VBNC، احیا اتفاق افتاد (52). در ارتباط با بیان ژن hly، Bunic و همکاران (1996) مشخص کرده اند فعالیت لیستریولیزین O پس از چندین هفته ماندن باکتری L. monocytogenes در دمای کم از دست می رود و خاصیت بیماریزایی آن پس از 24 ساعت انکوبه در دمای ºC37 بازمیگردد (53) که دلیل آن را میتوان به پروتئین PrfA که تنظیم‌کننده بیان ژنهای بیماریزای hly، inlA و actA است، نسبت داد که به دما وابسته است و در دمای زیر ºC30 بیان نمی شود (53). بیان این ژنها توسط Sigma-B نیز کنترل میشود که بیان این ژن ممکن است استرسهای فیزیولوژیکال در میکروارگانیسم را بهبود بخشد (53 -55)، همچنین فعالیت Sigma-B به مرحله رشد باکتری بستگی دارد که حداکثر فعالیت آن در فاز سکون باکتری است (56، 57). pH بهینه لیستریولیزین O 5/5 است و در7 pH: غیرفعال بود. فعالیت آنها دوباره با کاهش pH به 5/5 احیا شد (58). عدم بیان ژن inlA را میتوان در دسترس‌نبودن شرایط مغذی مورد نیاز برای روشن‌شدن آن بیان کرد.
مطالعات در ارتباط با باکتریهایی که تحت تنشهای مختلف فرآوری محصولات آماده مصرف قرار میگیرند و ممکن است تحت این شرایط وارد حالت VBNC شوند، نقش مهمی در برنامهریزی سلامت انسانها و حیوانات به عهده دارد. به دلیل اینکه این سلول‌ها ممکن است با یا بدون ورود به حالت VBNC خاصیت بیماریزایی خود را حفظ کنند و با مصرف محصول آماده مصرف، منجر به بیماری در مصرف‌کننده شوند و یا اینکه بیان ژنهای بیماریزا در بدن مصرف‌کننده از سر گرفته شود و منجر به مسمومیت یا مرگ مصرف‌کننده شود. درک بیشتر سلولهای VBNC ممکن است به ما در توضیح اینکه چرا شمار باکتریایی در زمستان کاهش می‌یابد، کمک کند.
در تحقیق حاضر مشاهده شد که طی دوره انجماد از تعداد باکتری های اولیه کاسته شد و بیان ژن خانه گردان 16S rRNA تا انتهای دوره ادامه داشت، اما با گذشت زمان بیان ژنهای بیماریزا متوقف شد، در عین حال خاصیت بیماریزایی با کشت در محیط بلاد آگار مجددا حاصل شد. همچنین ممکن است باکتری با ورود به بدن و قرارگرفتن در معرض شرایط مناسب رشدی، مجدداً خاصیت بیماریزایی‌اش را به دست آورد و موجب مسمومیت و مرگ مصرف‌کننده شود. این موضوع میتواند هشداری جدی برای تولیدکنندگان محصولات منجمد در ارتباط با بیماریزایی این پاتوژن برای مصرف‌کننده باشد. بنابراین بازبینی فرایند فرآوری محصولات شیلاتی و اخذ فرایندهای فرآوری بهتر قبل از مصرف توصیه می شود.
سپاسگزاری
از تمام کسانی که ما را در انجام این پژوهش یاری کردند، به‌ویژه مسئولان محترم آزمایشگاه‌های گروه میکروبیولوژی دانشکده پزشکی و گروه بیوتکنولوژی دانشگاه علوم پزشکی گلستان کمال تشکر و قدردانی را داریم.
تعارض منافع
نویسندگان هیچ‌گونه تعارض منافعی ندارند.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشی |
موضوع مقاله:
میکروب شناسی مواد غذایی
دریافت: 1397/10/22 | پذیرش: 1398/3/1 | انتشار الکترونیک: 1398/4/31
دریافت: 1397/10/22 | پذیرش: 1398/3/1 | انتشار الکترونیک: 1398/4/31
فهرست منابع
1. Weller D, Andrus A, Wiedmann M, den Bakker HC. Listeria Booriae sp. nov. and Listeria Newyorkensis sp. nov., From Food Processing Environments in the USA. Int J Syst Evol Microbiol. 2015; 65(1):286-292. [DOI:10.1099/ijs.0.070839-0] [PMID]
2. Foong ChS. The Ecology of Listeria Monocytogenes in Ready-to-Eat (RTE) Meat [PhD. Dissertation]. Ames, Iowa: Iowa State University; 2003.
3. Anonymous, The Community Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses and Zoonotic Agents in the European :union: in 2007. The EFSA Journal. 2009; 223(7):136-158. [DOI:10.2903/j.efsa.2009.223r]
4. Besnard V, Federighi M, Declerq E, Jugiao F, Cappelier JM. Environmental and Physico-Chemical Factors Induce VBNC State in Listeria Monocytogenes. INRA, EDP Sciences. 2002; 33(4):359-370. [DOI:10.1051/vetres:2002022] [PMID]
5. Farber JM, Daley EM, MacKie MT, Limerick B. A Small Outbreak of Listeriosis Potentially Linked to the Consumption of Imitation Crab Meat. Lett Appl Microbiol. 2000; 31(2):100-104. [DOI:10.1046/j.1365-2672.2000.00775.x] [PMID]
6. Oliver JD. The Public Health Significance of vViable but Nonculturable Bacteria. In: Colwell RR, Grimes DJ (Eds.), Nonculturable Microorganisms in the Environment. Berlin: Springer Science & Business Media; 2000. [DOI:10.1007/978-1-4757-0271-2_16]
7. Dillon RA, Patel TR. Listeria in Seafoods: A Review. J Food Prot. 1992; 55(12):1009-1015. [DOI:10.4315/0362-028X-55.12.1009] [PMID]
8. Kathariou S. Listeria Monocytogenes Virulence and Pathogenicity, A Food Safety Perspective. J Food Prot. 2002; 65(11):1811-1829. [DOI:10.4315/0362-028X-65.11.1811] [PMID]
9. Swaminathan B, Gerner-Smidt P. The Epidemiology of Human Listeriosis. Microbes Infect. 2007; 9(10):1236-1243. [DOI:10.1016/j.micinf.2007.05.011] [PMID]
10. Gasanov U, Hughes D, Hansbro PM. Methods for the Isolation and Identification of Listeria spp. and Listeria Monocytogenes: A Review. FEMS Microbiol. 2005; 29(5):851-875. [DOI:10.1016/j.femsre.2004.12.002] [PMID]
11. Oliver JD, Bockian R. In Vivo Resuscitation, and Virulence Towards Mice, of Viable but Nonculturable Cells of Vibrio Vulnificus. Appl Environ Microbiol. 1995; 61(7):2620-2623.
12. Oliver JD. The Viable but Non Culturable State in Bacteria. J Microbiol. 2005; 43:93-100.
13. Rice SA, McDougald D, Kjelleberg S. Vibrio Vulnificus: A Physiological and Genetic Approach to the Viable but Nonculturable Response. JIC. 2000; 6(2):115- 120. [DOI:10.1007/PL00012150]
14. Grey B, Steck TR. Concentrations of Copper Thought To Be Toxic to Escherichia coli Can Induce the Viable but Nonculturable Condition. Appl Environ Microbiol. 2001; 67(11):5325-5327. [DOI:10.1128/AEM.67.11.5325-5327.2001] [PMID] [PMCID]
15. Kong IS, Bates TC, Hülsmann A, Hassan H, Smith BE, Oliver JD. Role of Catalase and oxyR in the Viable but Nonculturable State of Vibrio Vulnificus. FEMS Microbiol Ecol. 2004; 50(3):133-142. [DOI:10.1016/j.femsec.2004.06.004] [PMID]
16. Suarez M, Gonzalez-Zorn B, Vega Y, Chico-Calero I, Vazquez-Boland J. A Rol for ActA in Epithelial Cell Invasion by Listeria Monocytogenes. Cell Microbiol. 2001; 3:853-864. [DOI:10.1046/j.1462-5822.2001.00160.x] [PMID]
17. Moors MA, Levitt B, Youngman P, Portnoy DA. Expression of Listeriolysin O and ActA by Intracellular and Extracellular Listeria Monocytogenes. Infect Immun. 1999; 67(1):131-139.
18. Wuenscher MD, Kohler S, Bubert A, Gerike U, Goebel W. The iap Gene of Listeria Monocytogenes is Essential for Cell Viability, and Its Gene Product, P60, has Bacteriolytic Activity. J Bacteriol. 1993; 175(11):3491-3501. [DOI:10.1128/jb.175.11.3491-3501.1993] [PMID] [PMCID]
19. Bierne H, Sabet C, Personnic N, Cossart P. Internalins: A Complex Family of Leucine-Rich Repeat-Containing Proteins in Listeria Monocytogenes. Microbes Infect. 2007; 9(10):1156-1166. [DOI:10.1016/j.micinf.2007.05.003] [PMID]
20. Camilli A, Tilney LG, Portnoy DA. Dual Roles of Plca in Listeria Monocytogenes Pathogenesis. Mol Microbiol. 1993; 8(1):143-157. [DOI:10.1111/j.1365-2958.1993.tb01211.x] [PMID] [PMCID]
21. Mizunoe Y, Wai SN, Ishikawa T, Takade A, Yoshida S. Resuscitation of Viable but Nonculturable Cells of Vibrio Parahaemolyticus Induced at Low Temperature Under Starvation. FEMS Microbiol Lett. 2000; 186(1):115-120. [DOI:10.1111/j.1574-6968.2000.tb09091.x] [PMID]
22. Oliver JD, Hite D, McDougald D, Andon NL, Simpson LM. Entry Into, and Resuscitation From, the Viable but Nonculturable State be Vibrio Vulnificus in an Estuarine Environment. Appl Environ Microbiol. 1995; 61(7):2624-2630.
23. Lindback T, Rottenberg ME, Roche SM, Rorvik LM. The Ability to Enter Into an Avirulent Viable but Non-Culturable (Vbnc) Form is Widespread Among Listeria Monocytogenesisolates From Salmon, Patients and Environment. Vet Res. 2010; 41(1):8. [DOI:10.1051/vetres/2009056] [PMID] [PMCID]
24. Cappelier JM, Besnard V, Roche S, Garrec N, Zundel E, Velge P, et al. Avirulence of Viable But Non-Culturable Listeria Monocytogenes Cells Demonstrated by In Vitro and In Vivo Models. EDP Sciences. 2005; 36(4):589-599. [DOI:10.1051/vetres:2005018] [PMID]
25. Jahncke ML, Collette RP, Hicks DT, Wiedmann M, Scott VN, Gall K. Treatment Options to Eliminate or Control Growth of Listeria Monocytogenes on Raw Material and on Finished Product for the Smoked Fish Industry. Food Protection Trends. 2004; 24(8):612-619.
26. Bozoglu TF, Ozilgen M, Bakir U. Survival Kinetics of Lactic Acid Starter Cultures During and After Freeze Drying. Enzyme and Microbial Technology. 1987; 9:531-537. [DOI:10.1016/0141-0229(87)90082-2]
27. Klaenhammer TR, Kleeman EG. Growth Characteristics, Bile Sensitivity, and Freeze Damage in Colonial Variants Of Lactobacillus Acidophilus. Appl Environ Microbiol. 1981; 41(6):1461-1467.
28. Nilsson L, Gram L, Huss HH. Growth Control of Listeria monocytogenes on Cold Smoked Salmon Using a Competitive Lactic Acid Bacteria. Flora J Food Prot. 1999; 62(4):336-342. [DOI:10.4315/0362-028X-62.4.336] [PMID]
29. Seu D, Boor KJ, Wiedmann M. sigB-Dependent Expression Patterns of Compatible Solute Transporter Genes opuCA and lmo1421 and the Conjugated Bile Salt Hydrolase Gene bsh in Listeria Monocytogenes. Microbiology. 2003; 149(11):3247-3256. [DOI:10.1099/mic.0.26526-0] [PMID]
30. Tan Q, Xu H, Chen T, Li P, Aguilar ZP, Xu D, Ming X, Xu F, Wei H. Differential Expression of Virulence and Stress Fitness Genes During Interaction Between Listeria Monocytogenes and Bifidobacterium Longum. Biosci Biotechnol Biochem. 2012; 76(4):699-704. [DOI:10.1271/bbb.110832] [PMID]
31. Tasara T, Stephan R. Evaluation of Housekeeping Genes in Listeria Monocytogenes as Potential Internal Control References for Normalizing mRNA Expression Levels in Stress Adaptation Models Using Real-Time PCR. FEMS Microbiol Lett. 2007; 269(2):265-272. [DOI:10.1111/j.1574-6968.2007.00633.x] [PMID]
32. Park YS, Lee SR, Kim YG. Detection of Escherichia coliO157:H7, Salmonella spp., Staphylococcus Aureus and Listeria Monocytogenesin Kimchi by Multiplex Polymerase Chain Reaction (mPCR). J Microbiol. 2006; 44(1):92-7.
33. Ragon M, Wirth T, Hollandt F, Lavenir R, Lecuit M, Le Monnier A, et al. Anew Perspectiveon Listeria Monocytogenes Evolution. PloS Pathogens. 2008; 4(9):e1000146. [DOI:10.1371/journal.ppat.1000146] [PMID] [PMCID]
34. Lou Y, Yousef AE. Characteristics of Listeria Monocytogenes Important to Food Processors. In: Ryser ET, Marth EH (eds.), Listeria, Listeriosis and Food Safety; 2 ed. New York: Marcel Dekker; 1999.
35. Uuchs RS. Listeria Monocytogenes. ASEAN Food J. 1992; 6:3-13.
36. Kuzmanović J, Ašanin R, Baltić M, Mišić D, Dimitrijević M, Stojanović M, et al. Presence of Listeria SPP in Fish Samples, Fish Product and Sea Products. Acta Veterinaria (Beograd). 2011; 61(2-3):193-203. [DOI:10.2298/AVB1103193K]
37. Fonseca F, Béal C, Corrieu G. Operating Conditions That Affect the Resistance of Lactic Acid Bacteria to Freezing and Frozen Storage. Cryobiology. 2001; 43(3):189-198. [DOI:10.1006/cryo.2001.2343] [PMID]
38. O'Brien KV, Aryana KJ, Prinyawiwatkul W, Ordonez KMC, Boeneke CA. The Effects of Frozen Storage on the Survival of Probiotic Microorganisms Found in Traditionally and Commercially Manufactured Kefir. J Dairy Sci. 2016; 99(9):7043-7048. [DOI:10.3168/jds.2015-10284] [PMID]
39. Chavarri F J, De Paz M, Nunez M. Cryoprotective Agents for Frozen Concentrated Starters From Non-Bitter Streptococcus Lactis Strains. Biotec Letters. 1988; 10(1):11-16. [DOI:10.1007/BF01030016]
40. Carvalho AS, Silva J, Ho P, Teixeira P, Malcata FX, Gibbs P. Relevant Factors for the Preparation of Freeze-Dried Lactic Acid Bacteria. Int Dairy J. 2004; 14(10):835-847. [DOI:10.1016/j.idairyj.2004.02.001]
41. Mazur, P. Cryobiology: The Freezing of Biological Systems. Science. 1970; 168(3934):939-949. [DOI:10.1126/science.168.3934.939] [PMID]
42. Brashears MM, Gilliland SE. Survival During Frozen and Subsequent Refrigerated Storage of Lactobacillus Acidophilus Cells as Influenced by the Growth Phase. J Dairy Sci. 1995; 78(11):2326-2335. [DOI:10.3168/jds.S0022-0302(95)76859-X]
43. Fernandez Murga ML, De Ruiz Holgado AP, De Valdez GF. Survival Rate and Enzyme Activities of Lactobacillus Acidophilus Following Frozen Storage. Cryobiology. 1998; 36(4):315-319. [DOI:10.1006/cryo.1998.2090] [PMID]
44. Harrison MA , Huang YW, Chao CH, Shineman T. Fate of Listeria Monocytogenes on Packaged, Refrigerated, and Frozen Seafood. J Food Prot. 1991; 54(7):524- 527. [DOI:10.4315/0362-028X-54.7.524] [PMID]
45. Palumbo SA, Williams A. Resistance of Listeria Monocytogenes to Freezing in Foods. Food Microbiol. 1991; 8(1):63-68. [DOI:10.1016/0740-0020(91)90017-V]
46. Wai SN, Mizunoe Y, Takade A, Yoshida S. A Comparison of Solid and Liquid Media for Resuscitation of Starvation- and Low-Temperature-Induced Nonculturable Cells of Aeromonas Hydrophila. Arch Microbiol. 2000; 173(4):307-310. [DOI:10.1007/s002030000142] [PMID]
47. Pawlowski DR, Metzger DJ, Raslawsky A, Howlett A, Siebert G, Karalus RJ, et al. Entry of Yersinia Pestis Into the Viable but Non Culturable State in a Low Temperature Tap Water Microcosm. PLoS One. 2011; 6(3):e17585. [DOI:10.1371/journal.pone.0017585] [PMID] [PMCID]
48. Zeng B, Zhao G, Cao X, Yang Z, Wang C, Hou L. Formation and Resuscitation of Viable but Nonculturable Salmonella Typhi. BioMed Res Int. 2013; 907170. [DOI:10.1155/2013/907170] [PMID] [PMCID]
49. Zolfaghari M, Rezaei M, Forozandeh Moghaddam M, Mohabbati Mobarez A, Hosseini H. The Effect of Stressful Conditions on Culturability of Listeria monocytogenes in Food Matrix. Iran J Med Microbiol. 2017; 11(5):149-158.
50. McGann P, Wiedmann M, Boor KJ. The Alternative Sigma Factor sB and the Virulence Gene Regulator PrfA Both Regulate Transcription of Listeria Monocytogenes Internalins. Appl Environ Microbiol. 2007; 73(9):2919-2930. [DOI:10.1128/AEM.02664-06] [PMID] [PMCID]
51. Duodu S, Holst-Jensen A, Skjerdal T, Cappelier JM, Pilet MF, Loncarevic S. Influence of Storage Temperature on Gene Expression and Virulence Potential of Listeria Monocytogenes Strains Grown in a Salmon Matrix. Food Microbiol. 2010; 27(6):795-801. [DOI:10.1016/j.fm.2010.04.012] [PMID]
52. Roszak DB, Grimes DJ, Colwell RR. Viable but Nonrecoverable Stage of Salmonella Enteritidis in Aquatic Systems. Can J Microbiol. 1984; 30(3):334-338. [DOI:10.1139/m84-049] [PMID]
53. Bunic S, Avery SM, Rogers AR. Listeriolysin O Production and Pathogenicity of Non-Growing Listeria Monocytogenes Stored at Refrigeration Temperature. Int J Food Microbil. 1996; 31(1-3):133-147. [DOI:10.1016/0168-1605(96)00973-7]
54. Ferreira A, O'Byrne CP, Boor KJ. Role of sB in Heat, Ethanol, Acid, and Oxidative Stress Resistance and During Carbon Starvation in Listeria Monocytogenes. Appl Environ Microbiol. 2001; 67(10):4454-4457. [DOI:10.1128/AEM.67.10.4454-4457.2001] [PMID] [PMCID]
55. Sue D, Fink D, Wiedmann M, Boor KJ. sB-Dependent Gene Induction and Expression in Listeria Monocytogenes During Osmotic and Acid Stress Conditions Simulating the Intestinal Environment. Microbiology. 2004; 150(Pt 11):3843-3855. [DOI:10.1099/mic.0.27257-0] [PMID]
56. Ferreira A, Sue D, O'Byrne CP, Boor KJ. Role of Listeria Monocytogenes SB in Survival of Lethal Acidic Conditions and in the Acquired Acid Tolerance Response. Appl Environ Microbiol. 2003; 69(5):2692-2698. [DOI:10.1128/AEM.69.5.2692-2698.2003] [PMID] [PMCID]
57. Sue D, Boor KJ, Wiedmann M. sB-Dependent Expression Patterns of Compatible Solute Transporter Genes Opuca and lmo1421 and the Conjugated Bile Salt Hydrolase Gene bsh in Listeria Monocytogenes. Microbiology. 2003; 149(Pt 11):3247-3256. [DOI:10.1099/mic.0.26526-0] [PMID]
58. Geoffroy C, Gaillard JL, Alouf JE, Berche PE. Purification, Characterization and Toxicity of the Sulfhydryl-Activated Hemolysin Listeriolysin 0 From Listeria Monocytogenes. Infect Immun. 1987; 55(1):1641-1646.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
