سال 13، شماره 1 - ( فروردین - اردیهبشت 1398 )
جلد 13 شماره 1 صفحات 31-22 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Rezavand S, Amani J, Akbari N, Mohajerani H R, Nazarian S, Mahmoodzadeh Hosseini H et al . Determination of PCR-ELISA Diagnostic Value in Comparison With Classical Methods and PCR to Detect Resistance to Methacillin. Iran J Med Microbiol 2019; 13 (1) :22-31
URL: http://ijmm.ir/article-1-795-fa.html
URL: http://ijmm.ir/article-1-795-fa.html
رضاوند سوسن، امانی جعفر، اکبری ندا، مهاجرانی حمید رضا، نظریان شهرام، محمود زاده حسینی حمیده و همکاران.. تعیین ارزش تشخیصی PCR-ELISA نسبت به روش‌های کلاسیک و PCR برای شناسایی سویه‌های استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین. مجله میکروب شناسی پزشکی ایران. 1398; 13 (1) :22-31
سوسن رضاوند1 
، جعفر امانی2 ، ندا اکبری1 ، حمید رضا مهاجرانی1 ، شهرام نظریان3 ، حمیده محمود زاده حسینی4 ، مهرداد موسی زاده مقدم5
، جعفر امانی2 ، ندا اکبری1 ، حمید رضا مهاجرانی1 ، شهرام نظریان3 ، حمیده محمود زاده حسینی4 ، مهرداد موسی زاده مقدم5
1- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم ژایه، واحد اراک، دانشگاه آزاد اسلامی، اراک، ایران
2- مرکز تحقیقات میکروبیولوژی کاربردی، انستیتو سیستم بیولوژی و مسمومیت‌ها، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله (عج)، تهران، ایران ،jafar.amani@gmail.com
3- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه امام حسین(ع)، تهران ، ایران
4- مرکز تحقیقات میکروبیولوژی کاربردی، انستیتو سیستم بیولوژی و مسمومیت‌ها، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله (عج)، تهران، ایران
5- مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی کاربردی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله (عج)، تهران، ایران
2- مرکز تحقیقات میکروبیولوژی کاربردی، انستیتو سیستم بیولوژی و مسمومیت‌ها، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله (عج)، تهران، ایران ،
3- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه امام حسین(ع)، تهران ، ایران
4- مرکز تحقیقات میکروبیولوژی کاربردی، انستیتو سیستم بیولوژی و مسمومیت‌ها، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله (عج)، تهران، ایران
5- مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی کاربردی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله (عج)، تهران، ایران
متن کامل [PDF 1071 kb]
(2077 دریافت)
| چکیده (HTML) (7432 مشاهده)
استافیلوکوکوس اورئوس از جمله مهم‌ترین عوامل ایجادکننده عفونت‌های بیمارستانی و اکتسابی در جامعه است و به دلیل قدرت بیماری‌زایی و مقاومت روز افزون در برابر عوامل ضدباکتریایی به یکی از مشکلات بهداشتی مهم در جهان تبدیل شده است (1، 2). این باکتری توانایی ایجاد طیف وسیعی از بیماری‌ها را دارد و از طریق تولید انواع توکسین‌ها، تهاجم مستقیم و تخریب بافت‌ها، تظاهرات بالینی مختلفی را پدید می‌آورد (3، 4). سالانه میلیون‌ها مورد عفونت‌های استافیلوکوکی در سراسر جهان گزارش می‌شود. با توجه به قدرت بیماری‌زایی و شیوع گسترده این باکتری، روش‌های مؤثر برای شناسایی آن به گونه‌ای که در عین سریع بودن، حساسیت و اختصاصیت بالایی نیز داشته باشد حائز اهمیت است. یکی از مشکلات اصلی در بیماری‌زایی باکتری بروز مقاومت‌های آنتی‌بیوتیکی از جمله مقاومت به متی‌سیلین است (5، 6).
هر چند در سال‌های اخیر روش‌های متعددی برای شناسایی استافیلوکوکوس اورئوس در نمونه‌های بیولوژیکی معرفی شده است، ولی هر کدام محدودیت‌های خاص خود را دارند. روش‌های مرسوم برای تشخیص استافیلوکوکوس اورئوس در نمونه‌های بالینی، محیط‌های کشت انتخابی، سنجش‌های بیوشیمیایی و روش آگلوتیناسیون است که روش‌هایی پیچیده و وقت‌گیر هستند. در حال حاضر روش‌های مولکولی همچون روش Multiplex PCRو Real-time PCR برای شناسایی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس استفاده می‌شود (7-9).
به کمک این روش‌های مولکولی زمان شناسایی نمونه حاوی باکتری از 4-3 روز به حدود 1/5 روز تقلیل یافته است. همچنین روش‌های PCR حساسیت کمی دارند و نیازمند کشت نمونه‌های بالینی برای تکثیر باکتری هستند که از نظر زمان و هزینه مقرون به‌صرفه نیست (10).
از دیگر روش‌های تشخیص، کیت‌های مبتنی بر آنتی‌بادی‌های منوکلونال هستند که هر چند اختصاصیت زیادی دارند، اما از لحاظ هزینه چندان مقرون به صرفه نیستند (10، 11). روش PCR-ELISA می‌تواند جایگزینی مناسبی برای موارد یادشده باشد؛ زیرا سرعت و حد تشخیص قابل قبولی را در شناسایی مقادیر اندک توالی‌های اختصاصی ژن بیماری فراهم می‌آورد. استفاده از دیگوکسی ژنین (Digoxigenin) نیز یک روش تشخیص مناسب و غیر رادیواکتیوی برای تشخیص محصولات PCR است. در این روش محصولات نشان‌دارشده توسط دیگوکسی ژنین به کمک آنتی‌بادی ضد DIG کونژوگه با آنزیم پراکسیداز شناسایی می‌شود (12). بر این اساس در تحقیق حاضر روش PCR-ELISA طراحی شد تا با استفاده از یک جفت پرایمر و یک پروب اختصاصی به همراه دیگوکسی‌ژنین محصولات PCR نشان‌دارشده، ژن mecA در باکتری استافیلوکوکوس اورئوس تشخیص داده شود.
پس از مطمئن‌شدن از مطلوب‌بودن پرایمرها با نرم‌افزارهای طراحی پرایمر، سفارش ساخت به شرکت سینا کلون (ایران) داده شد. واکنش PCR برای تکثیر ژن mecAدر حجم 25 میکرولیتر انجام گرفت. هر واکنش شامل 0/4 میکرومول از هر پرایمر، 0/5 واحد از آنزیم Taq DNA polymerase (شر کت سیناکلون، ایران)، 2/5 میکرولیتر بافر X10PCR ، غلظت 3 میلی مولار MgCl2 و غلظت‌های متفاوت از DNA ژنومی بود. برنامه دمایی PCR شامل واسرشتگی اولیه (Denaturation) در 95 درجۀ سلسیوس به مدت 5 دقیقه، واسرشتگی در 95 درجه به مدت 1 دقیقه، اتصال Annealing)) در59 درجه به مدت 30 ثانیه، تکثیر (Extension) در 72 درجه به مدت 40 ثانیه و تکثیر نهایی که در 72 درجه به مدت 5 دقیقه صورت گرفت. همچنین واکنش PCR در30 سیکل انجام شد. برای مشاهده محصول PCR، 5 میکرولیتر از محصول نهایی PCR بر روی ژل آگاروز 1 درصد تهیه‌شده از بافر TBE، الکتروفورز شد. به منظور تعیین اندازه محصول PCRاز نشانگر plus ladder bp 100 ساخت شرکت سیناژن (ایران) استفاده شد. برای مشاهده محصول، ژل توسط اتیدیوم بروماید رنگ‌آمیزی و تصویر ژل با استفاده از دستگاه Gel document (Omega, Germany) تهیه شد. در این تحقیق به منظور تأبید ژن تکثیریافته و برای شناسایی محصول PCR پروب طراحی شد (جدول 1). پروب با استفاده از نرم‌افزارهای Oligo وDNASIS – Primer3- BLAST و به منظور بررسی برخی ویژگی‌ها مانند دمای Tm، درصد GC، و احتمال تشکیل لوپ ارزیابی شد. پس از تأیید نهایی، ساخت پروب به صورت نشان‌دارشده با بیوتین به شرکت سینا کلون سفارش داده شد.
DNA ژنومی باکتری استخراج و غلظت آن 1200 نانوگرم در میکرولیتر تعیین شد. به منظور انجام واکنش PCR پرایمرهای اختصاصی برای ژن mecA طراحی شد که با بهینه‌کردن واکنش PCR، قطعه اختصاصی جفت بازی تکثیر شد. اختصاصیت پرایمر طراحی‌شده نیز با سایر باکتری‌ها بررسی شد. همان‌طور که در شکل 1 دیده می‌شود، پرایمرهای طراحی‌شده به طور اختصاصی منجر به تکثیر ژن mecA در باکتری استافیلوکوکوس اورئوس شده است.
بر اساس یافته‌های روش انتشار دیسک در حضور دیسک اگزاسیلین، 60 درصد از سویه‌های مطالعه‌شده به متی‌سیلین مقاوم بودند. بر اساس برنامه CLSI، رشد در حضور غلظت 8 میکروگرم بر میلی‌لیتر از آنتی‌بیوتیک اگزاسیلین به روش آگار دایلوشن به عنوان مقاومت به متی‌سیلین در نظر گرفته می‌شود. از این‌رو، با روش آگار دایلوشن نیز 58/5 درصد از سویه‌های مطالعه‌شده به متی‌سیلین مقاوم تشخیص داده شدند. همچنین در روش PCR –ELISA 60 درصد از سویه‌ها واجد ژن مقاومت بودند (شکل 6). تفاوت جزئی که بین سه روش وجود داشت نیز از لحاظ آماری معنی‌دار نبود.
امروزه باکتری استافیلوکوکوس اورئوس به عنوان عامل مهم بیماری‌زا در بیمارستان شناخته می‌شود. در 50 سال گذشته این باکتری تغییرات ژنتیکی زیادی را متحمل شده است. از آنجایی که این باکتری ژنوم انعطاف‌پذیری دارد، سویه‌های بیماری‌زا و مقاوم به داروی آن گسترش یافته است. در سال‌های اخیر نقش مهم استافیلوکوکوس اورئوس در ایجاد عفونت‌های بیمارستانی و نیز جامعه منجر به افزایش تحقیقات بسیاری بر روی این باکتری شده است (14). از جمله روش‌های تشخیص این باکتری می‌توان به روش‌های سنتی بر مبنای کشت باکتری، روش ردیابی بر پایه تکثیر اسید نوکلئیک، روش‌های ایمنی اگلوتیناسیون، و لاتکس اشاره کرد که هر کدام مزایا و معایبی دارند. روش PCR با وجود متداول‌بودن، معایبی نیز دارد؛ از جمله استفاده از ژل الکتروفورز و رنگ‌آمیزی با مواد سمی همچون اتیدیوم بروماید برای آشکارسازی محصولات تکثیرشده. همچنین همه این روش‌ها معایب خاص خود را دارند؛ از قبیل صرف زمان و محدودیت در تعداد نمونه‌های تشخیص. ایمونواسی‌ها بر اساس آنتی‌بادی برای تشخیص باکتری‌ها به‌خوبی جاافتاده‌اند و سال‌هاست که استفاده می‌شوند. یکی از مهم‌ترین عوامل شناسایی یک هدف، استفاده از مولکول شناساگری با اختصاصیت و تمایل زیاد است. یکی از رایج‌ترین این عوامل، آنتی‌بادی‌ها هستند که در بسیاری از روش‌های تشخیص ایمنی و زیست حسگرها استفاده می‌شوند (11).
در این تحقیق روش PCR-ELISA برای شناسایی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین به کار گرفته شده است. PCR-ELISA بسیاری از معایب و محدودیت‌های موجود در روش‌های دیگر، از جمله PCR را بر طرف کرده است، زیرا سرعت و اختصاصیت قابل قبولی را در تشخیص مقادیر اندک توالی‌های اختصاصی ژن بیماری فراهم می‌آورد؛ به طوری که حد تشخیص آن 0/01 ng/µl است. این میزان در روش PCR معمولی10-1 ng/µl است. همچنین برخلاف نتایج کیفی حاصل از PCR، یافته‌های روش PCR-ELISA به صورت نیمه‌کمّی است. اگرچه نتایج حاصل از روش qPCR به صورت کمّی و با حد تشخیص کمتر (pg/𝜇l 0/25) است، اما نیاز به دستگاه مجهز به فلورسانس و هزینه زیاد از معایب آن محسوب می‌شود.
از ویژگی‌های بارز روش PCR-ELISA تشخیصی امکان آنالیز هم‌زمان تعداد زیادی نمونه با استفاده از میکروپلیت‌های 96 خانه است. نیازنداشتن به دستگاه ژل داکت، اتاق تاریک ، امکان آلودگی کم نسبت به روش‌های لکه‌گذاری ساترن و استفاده‌نکردن از مواد گران‌قیمت که در روش PCR Real-time به کار می‌رود، از دیگر محاسن این روش محسوب می‌شود. در این روش ریسک آلودگی کارکنان آزمایشگاه بسیار کم است. همچنین خطر استفاده از اتیدیوم بروماید که در روش PCR برای رنگ‌آمیزی به کار می‌رود، وجود ندارد.
در تحقیقاتی که در زمینه باکتری‌هایی خانواده استافیلوکوک به روش PCR-ELISA صورت گرفته است، تاکنون گزارشی مبنی بر تشخیص مقاومت آنتی‌بیوتیکی استافیلوکوکوس اورئوس به روش PCR-ELISA ارائه نشده است و به نظر می‌رسد چنین پژوهشی برای اولین بار انجام می‌شود. Zhang و همکاران (2005) از روش Multiplex PCR برای تشخیص استافیلوکوکوس مقاوم به پنی‌سیلین استفاده کردند (15). Wolk و همکاران (2009) ترکیبی از روش‌های PCR و ESI-MS را برای تشخیص استافیلوکوکوس اورئوس به کار بردند (16). همچنین Graveland و همکاران (2010) (17) و Ružauskas و همکاران (2014) (18) آزمایشاتی روی نمونه‌های گوساله با روش PCR برای شناسایی این باکتری انجام دادند. روش PCR استفاده‌شده توسط محققان اگرچه روشی ارزان است و می‌تواند به‌آسانی در برخی از آزمایشگاه‌های تشخیص طبی مورد استفاده قرار گیرد، ولی کمّی‌نبودن نتایج و نیز پایین‌بودن نسبی میزان حساسیت آن در مقایسه با سایر روش‌های مولکولی از معایب آن محسوب می‌شود.
در این تحقیق از ژن کدکننده mecA به عنوان ژن شاخص برای شناسایی سویه‌های بیماری‌زای استافیلوکوکوس اورئوس واجد مقاومت به آنتی‌بیوتیک متی‌سیلین استفاده شد. استفاده از این ژن به عنوان هدف می‌تواند نشان‌دهندۀ بروز مقاومت آنتی‌بیوتیکی در جدایه‌ها باشد و به پزشک در انتخاب آنتی‌بیوتیک مناسب برای درمان بیمار کمک کند. درصد فراوانی جدایه‌های دارای مقاومت به متی‌سیلین را با روش‌هایی از قبیل انتشار دیسک ارزیابی می‌کنند. نتایج تحقیقات نشان داده است استفاده از روش‌های مولکولی در مقایسه با روش‌های آنتی‌بیوگرام می‌تواند سبب بهبود حساسیت تشخیص سویه‌های مقاوم شود. در تحقیق حاضر نیز تفاوتی در تعداد نمونه‌های مقاوم به متی‌سیلین با روش PCR-ELISA و آگار دایلوشن مشاهد شد؛ هرچند این تفاوت از لحاظ آماری معنی‌دار نبود. Najar (2009) نیز در تحقیقی نشان داد فراوانی ایزوله‌های مقاوم به متی‌سیلین در جدایه‌های بالینی به روش PCR و آگار دایلوشن بیشتر از روش انتشار دیسک است. هرچند این تفاوت نیز در تحقیق آنها از لحاظ آماری معنی‌دار نبود (19).
همان‌طور که اشاره شد روش PCR-ELISA منجر به افزایش میزان حساسیت تشخیص می‌شود. میزان حساسیت روش این تحقیق به گونه‌ای بود که امکان تأیید حضور 0/5 نانوگرم از ژنوم باکتری در نمونه را میسر ساخت. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد حساسیت روش تشخیص PCR-ELISA برای شناسایی استافیلوکوکوس اورئوس در مقایسه با نتایج ارائه‌شده مبتنی بر روش PCR، 100 برابر بیشتر است. بنابراین می‌توان نتیجه گرفت استفاده از PCR-ELISA می‌تواند سبب بهبود قابل توجهی در حساسیت تشخیص سویه‌های واجد مقاومت آنتی‌بیوتیکی شود. نتایج حساسیت تحقیق حاضر با نتایج تحقیق Gilligan (2000) همخوانی داشت. Gilligan نشان داد حساسیت روش PCR-ELISA برای شناسایی ایزوله‌های استافیلوکوکوس اورئوس واجد ژن کدکننده انتروتوکسین B 100 درصد است (20). با این حال حساسیت روش تشخیص PCR-ELISA ارائه‌شده در تحقیق حاضر 10 برابر کمتر از حساسیت تعریف‌شده در تحقیق Gilligan بود. میزان اختصاصیت روش در هر دو تحقیق مشابه بود و تأییدکننده دقت روش تشخیصی PCR-ELISA است.
ویژگی و اختصاصیت این روش در تشخیص باکتری‌های نیز بررسی شد. همان‌گونه که نتایج حاصل از بررسی‌ها در بانک ژنی نشان داد پرایمرها و پروب در این تحقیق برای باکتری استافیلوکوکوس اورئوس اختصاصی است. برای اثبات اینکه در عمل نیز چنین است، DNA ژنومی باکتری‌های کلبسیلا پنومونیه، باکتری اشریشیاکلی و باسیلوس سوبتلیس با روش PCR-ELISA بررسی و نتایج منفی حاصل شد.
در مقایسه با سایر روش‌های تشخیصی متداول برای تشخیص جدایه‌های استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین، روش این تحقیق حساسیت بیشتری دارد و می‌تواند تعداد نسخه‌های اندکی از ژن باکتری را تشخیص دهد. استفاده از ژن mecA و طراحی پرایمرهای اختصاصی سبب بالا رفتن ویژگی تشخیصی این روش شد؛ به طوری که گونه‌های دیگر در تحقیق با پرایمرها واکنش ندادند. همچنین استفاده از پروب اختصاصیت روش طراحی‌شده را به میزان زیادی بالا برد. به نظر می‌رسد روش PCR-ELISA برای تشخیص ایزوله‌های استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین روش مناسب و قابل اعتمادی باشد.
نویسندگان از تمامی کسانی که در انجام این تحقیق آنها را یاری کردند کمال تشکر و قدردانی را به عمل می‌آورند.
بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.
متن کامل: (3426 مشاهده)
مقدمه
استافیلوکوکوس اورئوس از جمله مهم‌ترین عوامل ایجادکننده عفونت‌های بیمارستانی و اکتسابی در جامعه است و به دلیل قدرت بیماری‌زایی و مقاومت روز افزون در برابر عوامل ضدباکتریایی به یکی از مشکلات بهداشتی مهم در جهان تبدیل شده است (1، 2). این باکتری توانایی ایجاد طیف وسیعی از بیماری‌ها را دارد و از طریق تولید انواع توکسین‌ها، تهاجم مستقیم و تخریب بافت‌ها، تظاهرات بالینی مختلفی را پدید می‌آورد (3، 4). سالانه میلیون‌ها مورد عفونت‌های استافیلوکوکی در سراسر جهان گزارش می‌شود. با توجه به قدرت بیماری‌زایی و شیوع گسترده این باکتری، روش‌های مؤثر برای شناسایی آن به گونه‌ای که در عین سریع بودن، حساسیت و اختصاصیت بالایی نیز داشته باشد حائز اهمیت است. یکی از مشکلات اصلی در بیماری‌زایی باکتری بروز مقاومت‌های آنتی‌بیوتیکی از جمله مقاومت به متی‌سیلین است (5، 6).
هر چند در سال‌های اخیر روش‌های متعددی برای شناسایی استافیلوکوکوس اورئوس در نمونه‌های بیولوژیکی معرفی شده است، ولی هر کدام محدودیت‌های خاص خود را دارند. روش‌های مرسوم برای تشخیص استافیلوکوکوس اورئوس در نمونه‌های بالینی، محیط‌های کشت انتخابی، سنجش‌های بیوشیمیایی و روش آگلوتیناسیون است که روش‌هایی پیچیده و وقت‌گیر هستند. در حال حاضر روش‌های مولکولی همچون روش Multiplex PCRو Real-time PCR برای شناسایی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس استفاده می‌شود (7-9).
به کمک این روش‌های مولکولی زمان شناسایی نمونه حاوی باکتری از 4-3 روز به حدود 1/5 روز تقلیل یافته است. همچنین روش‌های PCR حساسیت کمی دارند و نیازمند کشت نمونه‌های بالینی برای تکثیر باکتری هستند که از نظر زمان و هزینه مقرون به‌صرفه نیست (10).
از دیگر روش‌های تشخیص، کیت‌های مبتنی بر آنتی‌بادی‌های منوکلونال هستند که هر چند اختصاصیت زیادی دارند، اما از لحاظ هزینه چندان مقرون به صرفه نیستند (10، 11). روش PCR-ELISA می‌تواند جایگزینی مناسبی برای موارد یادشده باشد؛ زیرا سرعت و حد تشخیص قابل قبولی را در شناسایی مقادیر اندک توالی‌های اختصاصی ژن بیماری فراهم می‌آورد. استفاده از دیگوکسی ژنین (Digoxigenin) نیز یک روش تشخیص مناسب و غیر رادیواکتیوی برای تشخیص محصولات PCR است. در این روش محصولات نشان‌دارشده توسط دیگوکسی ژنین به کمک آنتی‌بادی ضد DIG کونژوگه با آنزیم پراکسیداز شناسایی می‌شود (12). بر این اساس در تحقیق حاضر روش PCR-ELISA طراحی شد تا با استفاده از یک جفت پرایمر و یک پروب اختصاصی به همراه دیگوکسی‌ژنین محصولات PCR نشان‌دارشده، ژن mecA در باکتری استافیلوکوکوس اورئوس تشخیص داده شود.
مواد و روش‌ها
سویه‌های باکتریایی و محیط‌های کشت
برای این منظور سویه استاندارد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (ATCC33592) از آزمایشگاه رفرانس تهیه شد و در محیط مایع LB (Luria Bertani) تلقیح و در دمای 37 درجه سلسیوس انکوبه شد. تست‌های بیوشیمیایی تأییدی مربوط به باکتری نیز انجام شد.
استخراج DNA ژنومی
برای انجام واکنش PCR استخراج DNA ژنومی باکتری با استفاده از روش لیزوزیم انجام گرفت. برای این منظور 5/1 میلی لیتر از محیط کشت حاوی باکتری رشدیافته به مدت10 دقیقه با دور rpm 3000 سانتریفوژ شد. رسوب سلول‌ها در 300 میکرولیتر بافر HTE (High Tris-EDTA) یکنواخت شد و 50 میکرولیتر لیزوزیم (mg/ml)10 در بافر TNE (Tris, NaCl, EDTA) (pH:7.4)، به محلول اضافه شد. بعد از به هم زدن در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت 15 دقیقه انکوبه شد. سپس300 میکرولیتر سارکوزیل 2 درصد (در بافر TE) و 5 میکرولیتر ازRNase (mg/ml10) در بافر (Tris-EDTA) TE به آن اضافه و در دمای 37 درجه سلسیوس برای 15 دقیقه قرار داده شد. در ادامه، 35 میکرولیتر از پروتئین K (mg/ml 20) به مخلوط واکنش اضافه و در 37 درجه سلسیوس به مدت 30 دقیقه انکوبه شد. برای حذف پروتئین‌ها و جداسازی محلول حاوی DNA از روش فنل-کلروفرم استفاده شد. در ادامه از استات سدیم 3 مولار و الکل مطلق برای ترسیب ژنوم استفاده شد. پس از شست وشوی رسوب با الکل 70 درصد، نمونه‌ها در دمای محیط خشک و رسوب ژنومی در 20 میکرولیتر بافر TE حل شد. ژنوم به دست آمده بر روی ژل آگارز 1 درصد بررسی و پس از تعیین غلظت با روش اسپکتروفوتومتری در 260 نانومتر برای مراحل بعدی کار استفاده شد.
واکنش PCR
به منظور تکثیر قطعه ژنی، یک جفت پرایمر اختصاصی طراحی شد. پرایمرهای طراحی شده با نرم افزارهای DNASIS، Oligo 5 از نظر Tm، ∆G، تشکیل لوپ و پرایمر دایمر بررسی شدند (جدول 1).
جدول 1. پرایمرها و پروب طراحی‌شده از ژن mecA
| تعداد نوکلئوتید | توالی نوکلئوتید | پرایمر/پروب |
| 21 باز | GAAATGACTGAACGTCCGATA | mecF |
| 25 باز | CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA | mecR |
| 20 باز | Biotin-AACATTGATCGCAACGTTCA | mecP |
پس از مطمئن‌شدن از مطلوب‌بودن پرایمرها با نرم‌افزارهای طراحی پرایمر، سفارش ساخت به شرکت سینا کلون (ایران) داده شد. واکنش PCR برای تکثیر ژن mecAدر حجم 25 میکرولیتر انجام گرفت. هر واکنش شامل 0/4 میکرومول از هر پرایمر، 0/5 واحد از آنزیم Taq DNA polymerase (شر کت سیناکلون، ایران)، 2/5 میکرولیتر بافر X10PCR ، غلظت 3 میلی مولار MgCl2 و غلظت‌های متفاوت از DNA ژنومی بود. برنامه دمایی PCR شامل واسرشتگی اولیه (Denaturation) در 95 درجۀ سلسیوس به مدت 5 دقیقه، واسرشتگی در 95 درجه به مدت 1 دقیقه، اتصال Annealing)) در59 درجه به مدت 30 ثانیه، تکثیر (Extension) در 72 درجه به مدت 40 ثانیه و تکثیر نهایی که در 72 درجه به مدت 5 دقیقه صورت گرفت. همچنین واکنش PCR در30 سیکل انجام شد. برای مشاهده محصول PCR، 5 میکرولیتر از محصول نهایی PCR بر روی ژل آگاروز 1 درصد تهیه‌شده از بافر TBE، الکتروفورز شد. به منظور تعیین اندازه محصول PCRاز نشانگر plus ladder bp 100 ساخت شرکت سیناژن (ایران) استفاده شد. برای مشاهده محصول، ژل توسط اتیدیوم بروماید رنگ‌آمیزی و تصویر ژل با استفاده از دستگاه Gel document (Omega, Germany) تهیه شد. در این تحقیق به منظور تأبید ژن تکثیریافته و برای شناسایی محصول PCR پروب طراحی شد (جدول 1). پروب با استفاده از نرم‌افزارهای Oligo وDNASIS – Primer3- BLAST و به منظور بررسی برخی ویژگی‌ها مانند دمای Tm، درصد GC، و احتمال تشکیل لوپ ارزیابی شد. پس از تأیید نهایی، ساخت پروب به صورت نشان‌دارشده با بیوتین به شرکت سینا کلون سفارش داده شد.
نشاندارکردن محصول PCR ژنومی به وسیله DIG-dUTP
برای نشاندارکردن محصول PCR ژن mecA از DIG- dUTP استفاده شد. برای این منظور در مخلوط dNTPS قسمتی از dTTP با DIG-dUTP جایگزین شد. در بعضی نقاط آنزیم Taq DNA پلیمر به جای dTTPاز DIG-dUTP در مقابل باز آدنین استفاده می‌کند. نسبت dTTP: DIG-dUTP استفاده‌شده 1:3 بود. علاوه بر نمونه اصلی، یک لوله به عنوان نمونه کنترل منفی و بدون DIG-dUTP در نظر گرفته شد که در آن مخلوط dNTP بدون DIG-dUTP به کار برده شد. واکنش PCR در حجم نهایی μl 25 تهیه و سیکل‌های حرارتی مانند قبل در نظر گرفته شد.
PCR-ELISA
برای این منظور 5 میکرولیتر استرپتواویدین با 95 میکرولیتر بافر پوششی در چاهک A،10 میکرولیتر محصول PCR نشان‌دارشده با دیگوکسی ژنین با90 میکرولیتر بافر پوششی در چاهک B،10 میکرولیتر محصول PCR عادی (غیرنشان‌دار) با 90 میکرولیتر بافر پوششی در چاهک C و D ،100 میکرولیتر بافر پوششی (Ag-) در چاهک E، 5 میکرولیتر محصول PCR عادی با 95 میکرولیتر بافر پوششی ریخته و به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس انکوبه شد. سپس چاهک‌ها 3 بار بافر PBST (فسفات سالین حاوی 05/0 درصد تویین) شست‌وشو داده شد. در مرحله بعد به هر کدام از چاهک‌ها 100 میکرولیتر از بافر بلاکینگ واجد 3 درصد BSA (Bovine serum albumin) اضافه و 45 دقیقه در دمای 37 درجه سلسیوس انکوبه شد. در ادامه چاهک‌ها همانند مرحله قبلی شست‌وشو داده شد. هم زمان با این مرحله 20 میکرولیتر محصول PCR نشان‌دارشده با DIG را در 80 میکرولیتر بافر دورگه‌سازی SSC (saline-sodium citrate) ریخته و مخلوط به مدت 5 دقیقه جوشانده شد. سپس به آن یک پیکومول پروب نشان‌دار که انتهای 5 آن بیوتینیله شده بود اضافه شد و به مدت 1 ساعت در دمای 55 درجه سلسیوس قرار گرفت. در ادامه این مخلوط در چاهک A ریخته شد و به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس قرار گرفت. بعد از 3 بار شست‌وشو با بافر PBST مقدار 100 میکرولیتر آنتی‌بادی ضد دیگوکسی ژنین نشان‌دار با پراکسیداز با رقت 1/1000 به هر کدام از چاهک‌ها اضافه شد و مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس انکوبه شد. پس از شست‌وشوی مجدد، 100 میکرولیتر از محلول سوبسترا شامل 5 میلی‌گرم OPD در 4 میلی‌لیتر بافر سیترات فسفات با 5 pH به همراه 5 میکرولیتر از آب اکسیژنه 30 درصد به هر چاهک اضافه شد و برای چند دقیقه در اتاقک تاریک نگهداری شد. در ادامه برای توقف واکنش از 100 میکرولیتر اسید سولفوریک 2/5 مولار استفاده شد. سپس جذب نوری با استفاده از دستگاه (ELISA Reader, Biotek USA) در طول موج 492 نانومتر خوانده شد.
تعیین حداقل غلظت ژنومی قابل تشخیص با روش PCR-ELISA با استفاده از محصولات PCR ژن mecA نشان‌دارشده
پس از تعیین غلظت محصول PCR ژن mecA نشان‌دارشده، به صورت سریالی رقت‌های مختلف بر حسب نانوگرم مختلف (520 نانوگرم تا 0/252 نانوگرم) تهیه شد. یک چاهک به عنوان کنترل منفی در نظر گرفته شد و10 ماکرولیتر از آن به هریک از چاهک‌ها اضافه شد و سایر مراحل آشکارسازی انجام و با دستگاه خواننده الایزا (ELISA reader) اندازه‌گیری شد.
تعیین میزان اختصاصیت روش PCR-ELISA
برای بررسی اختصاصیت پرایمرهای طراحی‌شده، از باکتری‌های کلبسیلا، باسیلوس سوبتلیس و اشریشیاکلی استفاده شد و آزمون PCR و سپس PCR-ELISA با آنها ارزیابی شد.
تشخیص نمونه‌های بالینی با استفاده از روش PCR-ELISA
تشخیص نمونه‌های بالینی با استفاده از روش PCR-ELISA
به منظور بررسی کارایی تشخیص تکنیک PCR-ELISA طراحی‌شده، 70 نمونه بالینی استفاده شد که از نظر وجود باکتری استافیلوکوکوس اورئوس مثبت تشخیص داده شدند. نمونه‌های مذکور از کشت خون، ادرار و زخم مراجعه‌کنندگان به آزمایشگاه‌های تشخیص طبی و بیمارستان‌های شهر اراک طی بازه زمانی اردیبهشت تا شهریور ماه 1395جمع‌آوری شده بودند. پس از کشت مجدد سویه‌های جداشده، هویت باکتری‌ها با روش‌های استاندارد شامل کاتالاز مثبت، DNaseمثبت، رشد در مانیتول سالت آگار تعیین و تأیید شد. در مرحله بعد، نمونه‌های حاوی استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین با روش انتشار دیسک غربال شدند. به طور خلاصه پس از کشت 24 ساعته، غلظت 0/5 مک فارلند از هر جدایه به صورت چمنی روی محیط Müller-Hinton agar حاوی 4 درصد کلرید سدیم و در مجاورت دیسک آنتی‌بیوتیک اگزاسیلین تهیه‌شده از شرکت HiMedia به مدت 24 ساعت در دمای 35 درجه سلسیوس کشت داده شد. نتایج مقاومت بر اساس برنامه شرکت سازنده دیسک بررسی شد. سپس به منظور تعیین MIC برای نمونه‌های مقاوم به متی‌سیلین، از روش آگار دایلوشن استفاده شد. برای این منظور از محیط کشت محیط Müller-Hinton agar حاوی 4 درصد کلرید سدیم و 8 میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک اگزاسیلین استفاده شد. به طور خلاصه، پس از کشت 24 ساعته، غلظت 0/5 مک فارلند از هر جدایه تهیه شد و تعداد 104 باکتری در این محیط Müller-Hinton agar کشت داده شد و نمونه‌ها در دمای 35 درجه سلسیوس به مدت 18 ساعت نگهداری شدند. در این آزمایش از استافیلوکوکوس اورئوس ATCC 33592 به عنوان کنترل مثبت استفاده شد (13).
یافته‌ها
DNA ژنومی باکتری استخراج و غلظت آن 1200 نانوگرم در میکرولیتر تعیین شد. به منظور انجام واکنش PCR پرایمرهای اختصاصی برای ژن mecA طراحی شد که با بهینه‌کردن واکنش PCR، قطعه اختصاصی جفت بازی تکثیر شد. اختصاصیت پرایمر طراحی‌شده نیز با سایر باکتری‌ها بررسی شد. همان‌طور که در شکل 1 دیده می‌شود، پرایمرهای طراحی‌شده به طور اختصاصی منجر به تکثیر ژن mecA در باکتری استافیلوکوکوس اورئوس شده است.
شکل 1. بررسی اختصاصیت واکنش PCR
ستون 1: محصولات واکنش PCR با باکتری استافیلوکوکوس اورئوس با طول 310جفت باز، ستون 2: نشانگر اندازه DNA (100bp DNA ladder)، ستون 3: کنترل منفی، ستون 4: محصولات واکنش PCR با باکتری کلبسیلا، ستون 5: محصولات واکنش PCR با باکتری اشریشیاکلی، ستون 6: محصولات واکنش PCR با باکتری باسیلوس سوبتلیس
ستون 1: محصولات واکنش PCR با باکتری استافیلوکوکوس اورئوس با طول 310جفت باز، ستون 2: نشانگر اندازه DNA (100bp DNA ladder)، ستون 3: کنترل منفی، ستون 4: محصولات واکنش PCR با باکتری کلبسیلا، ستون 5: محصولات واکنش PCR با باکتری اشریشیاکلی، ستون 6: محصولات واکنش PCR با باکتری باسیلوس سوبتلیس
شکل 2. نشاندارکردن محصول PCR با DIG-dUTP
ستون 1: نشانگر اندازه DAN (100bp DNA ladder)، ستون 2: محصول PCR نشان‌دارنشده، ستون 3: محصول PCR نشان‌دار شده
ستون 1: نشانگر اندازه DAN (100bp DNA ladder)، ستون 2: محصول PCR نشان‌دارنشده، ستون 3: محصول PCR نشان‌دار شده
شکل 3. آشکارسازی پلیت‌های میکروتیترحاوی آویدین. ردیف 1: محصول PCR نشان‌دارشده با DIG-dUTP، ردیف 2: محصول PCR نشان‌دارشده، ردیف 3: کنترل بدون آنتی‌ژن، ردیف 4: کنترل بدون آنتی‌بادی
در ادامه به منظور نشاندارکردن محصول PCR از DIG-dUTP استفاده شد. همان‌طور که در شکل 2 دیده می‌شود محصول PCR تکثیرشده با دیگوکسی ژنین نیز تک‌باند است و تا حدودی بیشتر از محصول PCR تکثیرشده با dNTPs عادی است. علت این امر وجود دیگوکسی ژنین در محصول PCR نشان‌دارشده است که باعث سنگین‌شدن قطعه مورد نظر شده است. این امر دلیلی بر انجام واکنش PCR در حضور DIG-dUTP است.
پس از نشاندارکردن محصولات PCR، آزمایش الایزا انجام گرفت و جذب نوری در طول موج 492 نانومتر با دستگاه ELISA Reader خوانده شد. همان‌طور که در شکل 3 مشاهده می‌شود میزان OD ثبت‌شده محصول PCR نشان‌دارشده ژن برابر 1/9 است که این میزان OD در حد قابل قبولی است.
برای بررسی حساسیت و تعیین حداقل غلظت ژنومی قابل تشخیص توسط روش تشخیصی PCR-ELISA ،از ژنوم تخلیص‌شده سریال رقت تهیه شد و پس از تکثیر قطعه مورد نظر با روش PCR به کمک الایزا آشکارسازی صورت گرفت (شکل 4). نتایج به‌دست‌آمده نشان‌دهندهه معنادار و قابل قبول بودن جواب‌ها در 4/0=OD برابر با رقت 1/2048 (غلظت 0/505 نانوگرم بر میکرولیتر) است.
در ادامه به منظور نشاندارکردن محصول PCR از DIG-dUTP استفاده شد. همان‌طور که در شکل 2 دیده می‌شود محصول PCR تکثیرشده با دیگوکسی ژنین نیز تک‌باند است و تا حدودی بیشتر از محصول PCR تکثیرشده با dNTPs عادی است. علت این امر وجود دیگوکسی ژنین در محصول PCR نشان‌دارشده است که باعث سنگین‌شدن قطعه مورد نظر شده است. این امر دلیلی بر انجام واکنش PCR در حضور DIG-dUTP است.
پس از نشاندارکردن محصولات PCR، آزمایش الایزا انجام گرفت و جذب نوری در طول موج 492 نانومتر با دستگاه ELISA Reader خوانده شد. همان‌طور که در شکل 3 مشاهده می‌شود میزان OD ثبت‌شده محصول PCR نشان‌دارشده ژن برابر 1/9 است که این میزان OD در حد قابل قبولی است.
برای بررسی حساسیت و تعیین حداقل غلظت ژنومی قابل تشخیص توسط روش تشخیصی PCR-ELISA ،از ژنوم تخلیص‌شده سریال رقت تهیه شد و پس از تکثیر قطعه مورد نظر با روش PCR به کمک الایزا آشکارسازی صورت گرفت (شکل 4). نتایج به‌دست‌آمده نشان‌دهندهه معنادار و قابل قبول بودن جواب‌ها در 4/0=OD برابر با رقت 1/2048 (غلظت 0/505 نانوگرم بر میکرولیتر) است.
شکل 4. تعیین حساسیت PCR-ELISA با سریال رقت ژنوم باکتری
اعداد 2 تا 4096 نشانگر سریال رقت ژنوم است و به ترتیب واجد 520 نانوگرم تا 0/252 نانوگرم بر میکرولیتر از ژنوم تخلیص‌شده است. -Ag: بدون آنتی‌ژن، -Ab: بدون آنتی‌بادی
اعداد 2 تا 4096 نشانگر سریال رقت ژنوم است و به ترتیب واجد 520 نانوگرم تا 0/252 نانوگرم بر میکرولیتر از ژنوم تخلیص‌شده است. -Ag: بدون آنتی‌ژن، -Ab: بدون آنتی‌بادی
اختصاصیت روش تشخیصی نیز با به‌کارگیری سایر باکتری‌ها ارزیابی شد. نتایج حاصل نشان‌دهندهاختصاصی‌بودن پرایمرهای طراحی‌شده بود؛ به طوری که برای سایر باکتری‌ها هیچ باندی بر روی ژل آگارز مشاهده نشد. سپس نتایج به‌دست‌آمده با روش PCR-ELISA مطابق اطلاعات ارائه‌شده در شکل 5 ارزیابی و ثبت شد. جذب نوری نمونه مربوط به استافیلوکوکوس اورئوس بیش از حد مقادیر کنترل‌های واکنش بود، در حالی که جذب نوری برای باکتری‌های دیگر کمتر از کنترل واکنش بود.
شکل 5. تعیین اختصاصیت PCR-ELISA با استفاده از سایر باکتری‌ها
1. استافیلوکوکوس اورئوس، 2. اشرشیا کلی، 3. کلبسیلا، 4. باسیلوس سرئوس، 5. بدون آنتی‌ژن، 6. بدون آنتی‌بادی
1. استافیلوکوکوس اورئوس، 2. اشرشیا کلی، 3. کلبسیلا، 4. باسیلوس سرئوس، 5. بدون آنتی‌ژن، 6. بدون آنتی‌بادی
بر اساس یافته‌های روش انتشار دیسک در حضور دیسک اگزاسیلین، 60 درصد از سویه‌های مطالعه‌شده به متی‌سیلین مقاوم بودند. بر اساس برنامه CLSI، رشد در حضور غلظت 8 میکروگرم بر میلی‌لیتر از آنتی‌بیوتیک اگزاسیلین به روش آگار دایلوشن به عنوان مقاومت به متی‌سیلین در نظر گرفته می‌شود. از این‌رو، با روش آگار دایلوشن نیز 58/5 درصد از سویه‌های مطالعه‌شده به متی‌سیلین مقاوم تشخیص داده شدند. همچنین در روش PCR –ELISA 60 درصد از سویه‌ها واجد ژن مقاومت بودند (شکل 6). تفاوت جزئی که بین سه روش وجود داشت نیز از لحاظ آماری معنی‌دار نبود.
شکل 6. تعیین مقاومت به متی‌سیلین در جدایه‌های بالینی استافیلوکوکوس اورئوس
بحث و نتیجه‌گیری
امروزه باکتری استافیلوکوکوس اورئوس به عنوان عامل مهم بیماری‌زا در بیمارستان شناخته می‌شود. در 50 سال گذشته این باکتری تغییرات ژنتیکی زیادی را متحمل شده است. از آنجایی که این باکتری ژنوم انعطاف‌پذیری دارد، سویه‌های بیماری‌زا و مقاوم به داروی آن گسترش یافته است. در سال‌های اخیر نقش مهم استافیلوکوکوس اورئوس در ایجاد عفونت‌های بیمارستانی و نیز جامعه منجر به افزایش تحقیقات بسیاری بر روی این باکتری شده است (14). از جمله روش‌های تشخیص این باکتری می‌توان به روش‌های سنتی بر مبنای کشت باکتری، روش ردیابی بر پایه تکثیر اسید نوکلئیک، روش‌های ایمنی اگلوتیناسیون، و لاتکس اشاره کرد که هر کدام مزایا و معایبی دارند. روش PCR با وجود متداول‌بودن، معایبی نیز دارد؛ از جمله استفاده از ژل الکتروفورز و رنگ‌آمیزی با مواد سمی همچون اتیدیوم بروماید برای آشکارسازی محصولات تکثیرشده. همچنین همه این روش‌ها معایب خاص خود را دارند؛ از قبیل صرف زمان و محدودیت در تعداد نمونه‌های تشخیص. ایمونواسی‌ها بر اساس آنتی‌بادی برای تشخیص باکتری‌ها به‌خوبی جاافتاده‌اند و سال‌هاست که استفاده می‌شوند. یکی از مهم‌ترین عوامل شناسایی یک هدف، استفاده از مولکول شناساگری با اختصاصیت و تمایل زیاد است. یکی از رایج‌ترین این عوامل، آنتی‌بادی‌ها هستند که در بسیاری از روش‌های تشخیص ایمنی و زیست حسگرها استفاده می‌شوند (11).
در این تحقیق روش PCR-ELISA برای شناسایی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین به کار گرفته شده است. PCR-ELISA بسیاری از معایب و محدودیت‌های موجود در روش‌های دیگر، از جمله PCR را بر طرف کرده است، زیرا سرعت و اختصاصیت قابل قبولی را در تشخیص مقادیر اندک توالی‌های اختصاصی ژن بیماری فراهم می‌آورد؛ به طوری که حد تشخیص آن 0/01 ng/µl است. این میزان در روش PCR معمولی10-1 ng/µl است. همچنین برخلاف نتایج کیفی حاصل از PCR، یافته‌های روش PCR-ELISA به صورت نیمه‌کمّی است. اگرچه نتایج حاصل از روش qPCR به صورت کمّی و با حد تشخیص کمتر (pg/𝜇l 0/25) است، اما نیاز به دستگاه مجهز به فلورسانس و هزینه زیاد از معایب آن محسوب می‌شود.
از ویژگی‌های بارز روش PCR-ELISA تشخیصی امکان آنالیز هم‌زمان تعداد زیادی نمونه با استفاده از میکروپلیت‌های 96 خانه است. نیازنداشتن به دستگاه ژل داکت، اتاق تاریک ، امکان آلودگی کم نسبت به روش‌های لکه‌گذاری ساترن و استفاده‌نکردن از مواد گران‌قیمت که در روش PCR Real-time به کار می‌رود، از دیگر محاسن این روش محسوب می‌شود. در این روش ریسک آلودگی کارکنان آزمایشگاه بسیار کم است. همچنین خطر استفاده از اتیدیوم بروماید که در روش PCR برای رنگ‌آمیزی به کار می‌رود، وجود ندارد.
در تحقیقاتی که در زمینه باکتری‌هایی خانواده استافیلوکوک به روش PCR-ELISA صورت گرفته است، تاکنون گزارشی مبنی بر تشخیص مقاومت آنتی‌بیوتیکی استافیلوکوکوس اورئوس به روش PCR-ELISA ارائه نشده است و به نظر می‌رسد چنین پژوهشی برای اولین بار انجام می‌شود. Zhang و همکاران (2005) از روش Multiplex PCR برای تشخیص استافیلوکوکوس مقاوم به پنی‌سیلین استفاده کردند (15). Wolk و همکاران (2009) ترکیبی از روش‌های PCR و ESI-MS را برای تشخیص استافیلوکوکوس اورئوس به کار بردند (16). همچنین Graveland و همکاران (2010) (17) و Ružauskas و همکاران (2014) (18) آزمایشاتی روی نمونه‌های گوساله با روش PCR برای شناسایی این باکتری انجام دادند. روش PCR استفاده‌شده توسط محققان اگرچه روشی ارزان است و می‌تواند به‌آسانی در برخی از آزمایشگاه‌های تشخیص طبی مورد استفاده قرار گیرد، ولی کمّی‌نبودن نتایج و نیز پایین‌بودن نسبی میزان حساسیت آن در مقایسه با سایر روش‌های مولکولی از معایب آن محسوب می‌شود.
در این تحقیق از ژن کدکننده mecA به عنوان ژن شاخص برای شناسایی سویه‌های بیماری‌زای استافیلوکوکوس اورئوس واجد مقاومت به آنتی‌بیوتیک متی‌سیلین استفاده شد. استفاده از این ژن به عنوان هدف می‌تواند نشان‌دهندۀ بروز مقاومت آنتی‌بیوتیکی در جدایه‌ها باشد و به پزشک در انتخاب آنتی‌بیوتیک مناسب برای درمان بیمار کمک کند. درصد فراوانی جدایه‌های دارای مقاومت به متی‌سیلین را با روش‌هایی از قبیل انتشار دیسک ارزیابی می‌کنند. نتایج تحقیقات نشان داده است استفاده از روش‌های مولکولی در مقایسه با روش‌های آنتی‌بیوگرام می‌تواند سبب بهبود حساسیت تشخیص سویه‌های مقاوم شود. در تحقیق حاضر نیز تفاوتی در تعداد نمونه‌های مقاوم به متی‌سیلین با روش PCR-ELISA و آگار دایلوشن مشاهد شد؛ هرچند این تفاوت از لحاظ آماری معنی‌دار نبود. Najar (2009) نیز در تحقیقی نشان داد فراوانی ایزوله‌های مقاوم به متی‌سیلین در جدایه‌های بالینی به روش PCR و آگار دایلوشن بیشتر از روش انتشار دیسک است. هرچند این تفاوت نیز در تحقیق آنها از لحاظ آماری معنی‌دار نبود (19).
همان‌طور که اشاره شد روش PCR-ELISA منجر به افزایش میزان حساسیت تشخیص می‌شود. میزان حساسیت روش این تحقیق به گونه‌ای بود که امکان تأیید حضور 0/5 نانوگرم از ژنوم باکتری در نمونه را میسر ساخت. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد حساسیت روش تشخیص PCR-ELISA برای شناسایی استافیلوکوکوس اورئوس در مقایسه با نتایج ارائه‌شده مبتنی بر روش PCR، 100 برابر بیشتر است. بنابراین می‌توان نتیجه گرفت استفاده از PCR-ELISA می‌تواند سبب بهبود قابل توجهی در حساسیت تشخیص سویه‌های واجد مقاومت آنتی‌بیوتیکی شود. نتایج حساسیت تحقیق حاضر با نتایج تحقیق Gilligan (2000) همخوانی داشت. Gilligan نشان داد حساسیت روش PCR-ELISA برای شناسایی ایزوله‌های استافیلوکوکوس اورئوس واجد ژن کدکننده انتروتوکسین B 100 درصد است (20). با این حال حساسیت روش تشخیص PCR-ELISA ارائه‌شده در تحقیق حاضر 10 برابر کمتر از حساسیت تعریف‌شده در تحقیق Gilligan بود. میزان اختصاصیت روش در هر دو تحقیق مشابه بود و تأییدکننده دقت روش تشخیصی PCR-ELISA است.
ویژگی و اختصاصیت این روش در تشخیص باکتری‌های نیز بررسی شد. همان‌گونه که نتایج حاصل از بررسی‌ها در بانک ژنی نشان داد پرایمرها و پروب در این تحقیق برای باکتری استافیلوکوکوس اورئوس اختصاصی است. برای اثبات اینکه در عمل نیز چنین است، DNA ژنومی باکتری‌های کلبسیلا پنومونیه، باکتری اشریشیاکلی و باسیلوس سوبتلیس با روش PCR-ELISA بررسی و نتایج منفی حاصل شد.
در مقایسه با سایر روش‌های تشخیصی متداول برای تشخیص جدایه‌های استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین، روش این تحقیق حساسیت بیشتری دارد و می‌تواند تعداد نسخه‌های اندکی از ژن باکتری را تشخیص دهد. استفاده از ژن mecA و طراحی پرایمرهای اختصاصی سبب بالا رفتن ویژگی تشخیصی این روش شد؛ به طوری که گونه‌های دیگر در تحقیق با پرایمرها واکنش ندادند. همچنین استفاده از پروب اختصاصیت روش طراحی‌شده را به میزان زیادی بالا برد. به نظر می‌رسد روش PCR-ELISA برای تشخیص ایزوله‌های استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین روش مناسب و قابل اعتمادی باشد.
سپاسگزاری
نویسندگان از تمامی کسانی که در انجام این تحقیق آنها را یاری کردند کمال تشکر و قدردانی را به عمل می‌آورند.
تعارض منافع
بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشی |
موضوع مقاله:
میکروب شناسی مولکولی
دریافت: 1396/9/28 | پذیرش: 1398/4/1 | انتشار الکترونیک: 1398/4/31
دریافت: 1396/9/28 | پذیرش: 1398/4/1 | انتشار الکترونیک: 1398/4/31
فهرست منابع
1. Nazari MR, Sekawi Z, Sadeghifard N, Raftari M, Ghafourian S. Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus: A Systematic Review. Rev Med Microbiol. 2015; 26(1):1-7. [DOI:10.1097/MRM.0000000000000023]
2. Laupland KB, Lyytikäinen O, Søgaard M, Kennedy KJ, Knudsen JD, Ostergaard C, et al .The Changing Epidemiology of Staphylococcus Aureus Bloodstream Infection: A Multinational Population-Based Surveillance Study. Clin Microbiol Infect. 2013; 19:465-471.
https://doi.org/10.1111/j.1469-0691.2012.03903.x [DOI:10.1111/1469-0691.12144] [PMID]
3. Tong SY, Davis JS, Eichenberger E, Holland TL, Fowler VG Jr. Staphylococcus Aureus Infections: Epidemiology, Pathophysiology, Clinical Manifestations, and Management. Clin Microbiol Rev. 2015; 28:603-661. [DOI:10.1128/CMR.00134-14] [PMID] [PMCID]
4. Chen CJ, Huang YC. New Epidemiology of Staphylococcus Aureus Infection in Asia. Clin Microbiol Infect. 2014; 20(7):605-623. [DOI:10.1111/1469-0691.12705] [PMID]
5. Hiramatsu K, Ito T, Tsubakishita S, Sasaki T, Takeuchi F, Morimoto Y, et al. Genomic Basis for Methicillin Resistance in Staphylococcus Aureus. Infect Chemother. 2013; 45:117-136. [DOI:10.3947/ic.2013.45.2.117] [PMID] [PMCID]
6. Purrello SM, Garau J, Giamarellos E, Mazzei T, Pea F, Soriano A, et al. Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus Infections: A Review of the Currently Available Treatment Options. J Glob Antimicrob Resist. 2016; 7:178-186. [DOI:10.1016/j.jgar.2016.07.010] [PMID]
7. Tan TY, Corden S, Barnes R, Cookson B. Rapid Identification of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus from Positive Blood Cultures by Real-Time Fluorescence PCR. J Clin Microbiol. 2001; 39(12):4529-4531. [DOI:10.1128/JCM.39.12.4529-4531.2001] [PMID] [PMCID]
8. Martineau F, Picard FJ, Roy PH, Ouellette M, Bergeron MG. Species-Specific and Ubiquitous-DNA-Based Assays for Rapid Identification of Staphylococcus Aureus. J Clin Microbiol. 1998; 36: 618-623.
9. Chapin K , Musgnug M. Evaluation of Three Rapid Methods for the Direct Identification of Staphylococcus Aureus From Positive Blood Cultures. J Clin Microbiol. 2003; 41: 4324-4327. [DOI:10.1128/JCM.41.9.4324-4327.2003] [PMID] [PMCID]
10. Hamula CL, Zhang H, Li F, Wang Z, Le XC, Li XF. Selection and Analytical Applications of Aptamers Binding Microbial Pathogens. Trends Analyt Chem. 2011; 30: 1587-1597. [DOI:10.1016/j.trac.2011.08.006]
11. Lee JO, So HM, Jeon EK, Chang H, Won K, Kim YH. Aptamers as Molecular Recognition Elements for Electrical Nanobiosensors. Anal Bioanal Chem. 2008; 390: 1023-1032. [DOI:10.1007/s00216-007-1643-y] [PMID] [PMCID]
12. Sue MJ, Yeap SK, Omar AR, Tan SW. Application of PCR-ELISA in Molecular Diagnosis. BioMed Res Int. 2014; 2014. [DOI:10.1155/2014/653014] [PMID] [PMCID]
13. Havaei SA, Halaji M, Vidovic S, Dillon Jo-AR, Karbalaei M, Ghanbari F, et al. Prevalence and Genotyping of Methicillin-Resistant and-Susceptible Staphylococcus Aureus Strains Isolated From Patients in a University Hospital, Isfahan, Iran. Jundishapur J Microbiol. 2017; 10: e13571. [DOI:10.5812/jjm.13571]
14. Hamdan-Partida A, Sainz-Espuñes T, Bustos-MartínezJ. Characterization and Persistence of Staphylococcus Aureus Strains Isolated From the Anterior Nares and Throats of Healthy Carriers in a Mexican Community. J Clin Microbiol. 2010; 48: 1701-1705. [DOI:10.1128/JCM.01929-09] [PMID] [PMCID]
15. Zhang K, McClure JA, Elsayed S, LouieT, Conly JM. Novel Multiplex PCR Assay for Characterization and Concomitant Subtyping of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus. J Clin Microbiol. 2005; 43: 5026-33. [DOI:10.1128/JCM.43.10.5026-5033.2005] [PMID] [PMCID]
16. Wolk DM, Blyn LB, Hall TA, Sampath R, Ranken R, Ivy C,et al. Pathogen Profiling: Rapid Molecular Characterization of Staphylococcus Aureus by PCR/Electrospray Ionization-Mass Spectrometry and Correlation With Phenotype. J Clin Microbiol. 2009; 4737-3129. [DOI:10.1128/JCM.00709-09] [PMID] [PMCID]
17. Graveland H, Wagenaar JA, Heesterbeek H, Mevius D, Van Duijkeren E, Heederik D. Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus ST398 in Veal Calf Farming: Human MRSA Carriage Related With Animal Antimicrobial Usage and Farm Hygiene. PLoS One. 2010; 5(6): e10990. [DOI:10.1371/journal.pone.0010990] [PMID] [PMCID]
18. Ružauskas M, Couto N, Šiugždinienė R, Belas A, Klimienė I, Virgailis M, et al. Occurrence and Characterization of Livestock-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus. Veterinarija ir Zootechnika. 2014; 66.
19. Najar PS, Azimian A, Mostafaei M, Siadat SD. Identification of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus by Disk Diffusion Method, Determination of MIC and PCR for MecA Gene. Pathobiol Res. 2009; 12:61-69.
20. Gilligan K, Shipley M, Stiles B, Hadfield TL, Ibrahim MS. Identification of Staphylococcus Aureus Enterotoxins A and B Genes by PCR-ELISA. Mol Cell Probes. 2000; 14:71-78. [DOI:10.1006/mcpr.2000.0286] [PMID]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
