سال 13، شماره 1 - ( فروردین - اردیهبشت 1398 )
جلد 13 شماره 1 صفحات 68-56 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Arian S, Kaboosi H, Heshmatipour Z, Khazaei -Koohpar Z, Peyravii-Ghadikolaii F. Molecular analysis of seven Lactobacillus strains isolated from human origin in West of Mazandaran.. Iran J Med Microbiol 2019; 13 (1) :56-68
URL: http://ijmm.ir/article-1-919-fa.html
URL: http://ijmm.ir/article-1-919-fa.html
آرین سیمین، کابوسی حامی، حشمتی پور زهیر، خزائی کوهپر زینب، پیروی قادیکلایی فاطمه. آنالیز مولکولی هفت سویه لاکتوباسیلوس جداشده با منشأ انسانی در غرب مازندران به منظور شناسایی جدایه‌هایی با توانایی پروبیوتیکی. مجله میکروب شناسی پزشکی ایران. 1398; 13 (1) :56-68
1- گروه میکروبیولوژی، واحد آیت الله آملی، دانشگاه آزاد اسلامی، آمل، ایران
2- گروه میکروبیولوژی، واحد آیت الله آملی، دانشگاه آزاد اسلامی، آمل، ایران ، hkaboosi@gmail.com
3- گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد تنکابن، دانشگاه آزاد اسلامی، تنکابن، ایران
4- گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی، دانشکده علوم زیستی، واحد تنکابن، دانشگاه آزاد اسلامی، تنکابن، ایران
5- گروه زیست شناسی، واحد قائم شهر، دانشگاه آزاد اسلامی، قائم شهر، ایران
2- گروه میکروبیولوژی، واحد آیت الله آملی، دانشگاه آزاد اسلامی، آمل، ایران ، hkaboosi@gmail.com
3- گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد تنکابن، دانشگاه آزاد اسلامی، تنکابن، ایران
4- گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی، دانشکده علوم زیستی، واحد تنکابن، دانشگاه آزاد اسلامی، تنکابن، ایران
5- گروه زیست شناسی، واحد قائم شهر، دانشگاه آزاد اسلامی، قائم شهر، ایران
واژه‌های کلیدی: پروبیوتیک‌های جدید، لاکتوباسیلوس فرمانتوم، لاکتوباسیلوس رامنوسوس، آنالیز مولکولی، غرب مازندران
متن کامل [PDF 1657 kb]
(2427 دریافت)
| چکیده (HTML) (5711 مشاهده)
استفاده از پروبیوتیک راهکار امیدبخشی برای درمان و جلوگیری از سرطان کلورکتال محسوب می‌شود. پروبیوتیک‌ها میکروارگانیسم‌های زنده‌ای هستند که در مقادیر مشخص می‌توانند در سلامتی میزبان مؤثر باشند (1، 2). در دستگاه گوارش انسان یک مجموعه پیچیده با بیش از 100 تریلیون سلول میکروبی وجود دارد که در فیزیولوژی، تغذیه و متابولیسم انسان تأثیر می‌گذارند. باکتری‌های گوارشی در سنتز ویتامین B و K و متابولیزه‌کردن اسیدهای چرب، استرول‌ها و زنوبیوتیک‌ها نقش دارند (3). با این حال باکتری‌های هم‌سفره، توانایی فعال‌کردن پاسخ ایمنی را نیز دارند. فرستادن سیگنال توسط میکروفلور معده و روده همراه با سد اپی‌تلیالی اولین خط دفاعی دستگاه گوارش علیه پاتوژن‌ها محسوب می‌شود (4). مهم‌ترین سویه‌های پروبیوتیک از باکتری‌های اسید لاکتیکی (LAB) از جنس بیفیدوباکتر و لاکتوباسیلوس هستند (1).
باکتری‌های اسید لاکتیکی (LAB) در ماست، پنیر، شیر، نوشیدنی‌ها، اسموتی‌ها، غلات و ... وجود دارند. بهترین pH برای رشد لاکتوباسیلوس 5- 6/5 است، همچنین تراکم 5 درصد دی‌اکسید کربن تأثیر بسزایی بر رشد آنها دارد. لاکتوباسیلوس‌ها در شرایط بی‌هوازی با حداقل اکسیژن رشد دارند؛ برای مثال در بدن در بزاق دهان، واژن و در محیط تیوگلیکولات از کوکسی به باسیل تغییر می‌کنند. این باکتری‌ها تخمیرکننده هستند و بیشتر محصولات آنها اسید لاکتیک است و خاصیت پروبیوتیکی دارند. مصرف این باکتری‌ها در ترکیبات دارویی توازن طبیعی باکتری و قارچ را در دستگاه گوارش تنظیم میکند. لاکتوباسیل‌ها که به صورت فلور طبیعی در انسان دیده می‌شود عبارتند از: لاکتوباسیلوس بیفیدوس در پلاک دندانی و بزاق افراد بزرگسال و در مدفوع نوزادانی که از شیر مادر تغذیه می‌کنند. مطالعات بر روی مدل‌های حیوانی و جمعیت انسانی نشان داده است مصرف پروبیوتیک‌ها در شرایطی چون تحمل‌نکردن لاکتوز، اسهال القاشده با آنتی‌بیوتیک، التهاب معده و روده، یبوست و عفونت‌های مجاری گوارشی سودمند است (5).
مطالعات مختلف نشان داده است نرخ وقوع (Colorectal Cancer) CRC در افراد سالمی که به طور مرتب از محصولات لبنی تخمیری (حاوی پروبیوتیک) به‌خصوص ماست استفاده می‌کنند، کاهش یافته است (1). به نظر می‌رسد اثرات ضدسرطانی پروبیوتیک‌ها به واسطه تنظیم پاسخ ایمنی، القای اپوپتوز و خواص آنتی‌اکسیدانی آنها باشد. همچنین اثبات شده است روده به طور طبیعی از طریق آنزیم‌های گلیکوزیداز، 𝛽-گلوکورونیداز، آزوردوکتاز و نیتروردوکتاز پیش‌سرطان‌زاها را به سرطان‌زاهای فعال تبدیل میکند. پروبیوتیک‌ها به‌خصوص لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس کازئی سبب کاهش فعالیت این آنزیم‌ها می‌شوند (6). یک ترکیب نامتوازن میکروبی در دستگاه گوارش می‌تواند شرایط را برای کارسینوژنز کولونی مهیا سازد. در حالی که مصرف روزانه سویه‌های خاص پروبیوتیک می‌تواند باعث بازگرداندن توازن میکروبیوتا، سلامتی فرد و مهار کلونی زایی میکروارگانیسم‌های پاتوژن در روده شود (7).
در یک مطالعه نشان داده شد لاکتوباسیلوس رامنوسوس GG اثر مهاری بر روی کارسینوژنز کولونی القاشده با دی متیل هیدارزین (DMH) دارد (8). در یک آزمون بالینی بر روی افراد مبتلا به CRC مصرف خوراکی پروبیوتیک‌ها باعث افزایش تعداد لاکتوباسیلوس، بیفیدوباکتر و انتروکوکوس و کاهش تعداد E.coli و استافیلوکوکوس آئروئوس شد. از سوی دیگر خصوصیات فیزیکوشیمیایی هضم در کولون از جمله pH، ویسکوزیته و میزان اسیدهای صفراوی در موارد مبتلا به CRC دچار تغییر می‌شود. این شرایط محیطی می‌تواند به واسطه پروبیوتیک‌ها تغییر یابد و باعث مقاومت به کارسینوژنز شود (7). با توجه به مطالعات in vitro و in vivo، به نظر می‌رسد پروبیوتیک‌ها توان مهار رشد، پیشرفت و درمان سرطان کلورکتال را داشته باشند (9). با توجه به شواهد آزمایشگاهی و بالینی قوی از تأثیرات مثبت پروبیوتیک‌ها بر سرطان‌زایی کولون، نیاز است تا گونه‌هایی که خاصیت ضدتوموری بیشتری دارند و گونه‌های مختلف از پروبیوتیک‌ها که تأثیرات متفاوتی به عنوان مکمل دارویی در پیشگیری یا درمان سرطان کلورکتال نشان داده‌اند شناسایی شوند. در این مطالعه تلاش شد دو جدایه لاکتوباسیلوس از نظر خصوصیات میکروبی و مولکولی (فیلوژنتیکی) بررسی شود.
جداسازی باکتری
در این مطالعه مقطعی و آزمایشگاهی از سال 1395 تا 1396، مطابق با اصول پرسشنامه طراحی‌شده، از مدفوع 60 فرد سالم از نظر گوارشی در بیمارستان‌ها و مراکز درمانی شهر تنکابن نمونه‌گیری شد. سپس نمونه‌ها در دمای 4 درجه سانتی‌گراد تا زمان آزمایش نگهداری شدند. افراد در محدوده سنی 2 ماه تا 40 سال و سالم از نظر گوارشی در این مطالعه وارد و بین آنها افرادی که بیماری گوارشی داشتند از مطالعه خارج شدند. همچنین در این تحقیق تأییدیه کمیته اخلاق از دانشگاه آزاد اسلامی واحد تنکابن به شناسه IR.IAU.TON.REC.1397.032 گرفته شد. جدایه‌ها در محیط کشت MRS (محیط کشت اختصاصی لاکتوباسیل‌ها برگرفته از نام‌های Man Rogosa و Sharpe که در سال 1960 آن را تهیه شده و ترکیبی از گلوکوز، عصاره گوشت و عصاره مخمر همراه با tween 80، منیزیم و منیزم سولفات به عنوان محرک رشد، آمونیوم سیترات و سدیم استات است) گسترده و در دمای ◦C37 به مدت 24 ، 48 و 72 ساعت در شرایط بی هوازی انکوبه شدند. از این تعداد نمونه، 50 ایزوله باکتریایی جداسازی شد. برای تعیین سویه‌های لاکتوباسیلوس تست‌های مختلفی شامل رنگ‌آمیزی گرم، بررسی مورفولوژی، فعالیت کاتالاز، تخمیر کربوهیدرات، تست مقاومت به pH و تست تحمل نمک‌های صفراوی صورت گرفت.
آزمون مقاومت آنتی‌بیوتیکی
مقاومت آنتی‌بیوتیکی جدایه‌ها در محیط MRS براث به روش انتشار از دیسک (Baur-Kirby) و طبق استاندارد CLSI 2013 با استفاده از دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی سفالکسین، سفوکسیم، آموکسی سیلین، آمپی سیلین، پنیسیلین، ونکومایسین، کلیندامایسین، سولفومتاکسازول، ریفامپین، نئومایسین، اریترومایسین، تتراسایکلین، جنتامایسین، کانامایسین، کلرامفنیکل تهیه‌شده از شرکت High Media (هند)، تعیین شد. بعد از 48 ساعت انکوباسیون در جار بی‌هوازی در دمای °C37، قطر هاله عدم رشد اطراف هر دیسک اندازه‌گیری و نتایج آن ثبت شد.
تست حرکت
جدایه‌ها به کمک سوزن (نیدل) در محیط کشت SIM به صورت عمودی در مرکز محیط تا اواسط لوله وارد شد. سپس در یک جار بی‌هوازی به مدت 48 ساعت در دمای ◦C37 انکوبه شد. سپس منفی یا مثبت بودن حرکت بررسی شد.
تست مقاومت به pH
برای تعیین شرایط اسیدی معده، 7 جدایه لاکتوباسیلوس در محیط کشت MRS به مدت 18 ساعت در ◦C37 انکوبه شدند. بعد از تهیه محیط MRS جدید با pHهای 2/5، 3، 3/5، 4، 4/5 و 5، جدایه‌ها به این محیط اضافه و به مدت 24 تا 48 ساعت در ◦C37 انکوبه شدند. سپس نتایج کشت نسبت به کدورت نیم مک فارلند بررسی شد. برای مقایسه میزان مقاومت جدایه‌ها در pHهای مختلف از آزمون کروسکال والیس استفاده شد.
تست تحمل نمک‌های صفراوی
محلول نمک صفراوی دزوکسی کولات با غلظت 0/3 درصد به 100 میکرولیتر محیط MRS اضافه و 100 میکرولیتر از جدایه‌ها به طور جداگانه به این محیط اضافه و در جار بی‌هوازی در دمای ◦C37 انکوبه شد. میزان جذب نوری جدایه‌ها در زمان‌های صفر، 30 دقیقه، 2 ساعت، 4 ساعت و 24 ساعت بعد از تلقیح، با دستگاه اسپکتوفتومتر و طول موج 600 نانومتر خوانده شد. از محیط کشت فاقد باکتری به عنوان نمونه بلانک استفاده شد.
آنالیز مولکولی جدایه‌های لاکتوباسیلوس
به منظور تأیید مولکولی ایزوله‌های جداسازی‌شده به عنوان سویه پروبیوتیک، ابتدا استخراج DNA با استفاده از کیت High Pure-Template PCR preparation (شرکت Roche، سوئیس) صورت گرفت. سپس تکثیر ژن 16s rRNA به روش PCR و با استفاده از مستر میکس (Amplcon، دانمارک) با غلظت 12/5 ماکرولیتر، DNA با غلظت 5 ماکرولیتر در حجم نهایی 25 ماکرولیتر، در ترمال سایکلر ABI2720 طبق برنامه ذیل انجام شد: یک مرحله واسرشت‌شدن ابتدایی در °C95 به مدت 5 دقیقه، 35 سیکل در دمای °C95 به مدت 1 دقیقه، °C60 به مدت 1 دقیقه، °C72 به مدت 75 ثانیه و یک مرحله گسترش نهایی در دمای °C72 به مدت 10 دقیقه. در این مطالعه از پرایمرهای فراگیر (جهانی) با غلظت 0/5 ماکرولیتر و با توالی زیر استفاده شد: پرایمر مستقیم 5'-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3' و پرایمر برگشتی 5'-TACGGTACCTTGTTACGACTT-3' (10). بعد از اطمینان از تک‌باند بودن محصولات PCR، نمونه‌ها با حفظ زنجیره سرمایی به منظور تعیین توالی به شرکت ماکروژن کشور کره جنوبی فرستاده شد. نتایج حاصل به کمک نرمافزار CLC Main Workbench v3.5 و نرمافزار آنلاین بلاست (BLAST) خوانش و با نرمافزار Mega7 از نظر قرابت ژنتیکی ارزیابی شد.
آنالیز اماری
در این مطالعه از آزمون کلموگروف-اسمیرنوف، آزمون تحلیل واریانس و آزمون تعقیبی توکی استفاده شد. داده‌ها بصورت میانگین±انحراف معیار نشان داده شد.
تحلیل آزمون‌های میکروب‌شناسی
در این مطالعه هفت باسیل با ویژگی‌های کاتالاز منفی و گرم مثبت تعیین شدند که در تست حرکت، منفی بودند. نتایج آنتی‌بیوگرام 7 جدایه لاکتوباسیل که به صورت کدگذاری‌شده، نام‌گذاری شدند، در جدول 1 نشان داده شده است. بر اساس نتایج آنتی‌بیوگرام مشخص شد هر 7 جدایه به جنتامایسین، نئومایسین، سولفومتاکسازول و کانامایسین مقاوم بودند. همچنین 5 جدایه به ونکومایسین مقاومت نشان دادند. در حالی که همه جدایه‌ها به آموکسی‌سیلین، آمپی‌سیلین، تتراسایکلین، پنیسیلین و کلرامفنیکل حساس بودند.
نتایج مقاومت به pH های مختلف در 7 جدایه به صورت 3 درجه از رشد (1: رشد ضعیف، 2: رشد خوب و 3: رشد عالی) در جدول 2 نشان داده شده است. به طوری که جدایه‌های SG و SN5 در 3/5≤ pH، جدایه SE در همه pHها، جدایه SK در 3≤ pH، جدایه SL ، SO و SN3در 4≤ pH رشد عالی داشتند که نشان‌دهنده مقاومت آنها به pH های مختلف بود.
میزان جذب نوری در جدایه‌ها نشان داد جدایه‌ها توان تحمل نمک‌های صفراوی را دارند و تفاوت حاصل از رشد آنها به کمک آزمون تعقیبی توکی در ساعات مختلف تفاوت معنی‌داری (P-Value<0.05) را نشان داد (جدول 3). به طوری که بیشترین میزان جذب نوری برای جدایه SG، دو ساعت بعد از تیمار با اسید صفراوی گزارش شد که میزان آن با دیگر ساعات تیمار تفاوت معناداری را نشان داد. در جدایه‌های SE ، SK ، SL و SN5 بیشترین میزان جذب مربوط به زمان 24 ساعت بود که با میزان جذب در بقیه زمان‌ها تفاوت معناداری داشت. در جدایه SO بیشترین میزان جذب نوری مربوط به زمان‌های 2، 4 و 24 ساعت گزارش شد. در جدایه SN3 ، بیشترین و کمترین میزان جذب نوری به ترتیب مربوط به 4 ساعت و 2 ساعت بود.
آنالیز مولکولی
نتایج آنالیز توالی ژن 16s rRNA نشان داد جدایه‌های SG و SL از نوع لاکتوباسیلوس رامنوسوس، جدایه‌های SE وSK از نوع لاکتوباسیلوس فرمانتوم، جدایه‌های SO و SN5از نوع انتروکوکوس فاسیوم و جدایه SN3 از نوع انتروکوکوس دورانس است. همچنین در بررسی فیلوژنی هفت جدایه بررسی‌شده مشخص شد جدایه SE با سویه‌های لاکتوباسیلوس فرمانتوم حدود 86 درصد قرابت ژنتیکی دارد و بر اساس درصد قرابت داخل درخت فیلوژنی، به نظر می‌رسد جدایه SE یک سویه جدید از لاکتوباسیلوس فرمانتوم در استان مازندران باشد (شکل 1). همچنین جدایه SG با سویه‌های L10 و L15 لاکتوباسیلوس رامنوسوس 61 درصد قرابت ژنتیکی نشان داد (شکل 2)، که بر اساس درصد قرابت داخل درخت فیلوژنی، جدایه SG نیز احتمالاً یک سویه جدید از لاکتوباسیلوس رامنوسوس باشد. جدایه SL قرابت کم 16 درصد به گونه لاکتوباسیلوس رامنوسوس و لاکتوباسیلوس فرمانتوم داشت (شکل 3). جدایه‌های SO و SN با سویه‌های انتروکوکوس فاسیوم حدود 99 درصد قرابت ژنتیکی داشتند که بر اساس آنالیز فیلوژنیک به عنوان یک سویه جدید انتروکوکوس فاسیوم معرفی می‌شود (شکل 4).
پروبیوتیک‌ها به عنوان مکمل‌های میکروبی غذایی با توان حفظ توازن میکروبی در دستگاه گوارش می‌توانند نقش مؤثری در حفظ سلامتی میزبان داشته باشند. اثرات ضدسرطانی پروبیوتیک‌ها از گونه‌های لاکتوباسیلوس، بیفیدوباکتر و انتروکوک در مطالعات مختلف در سرطان کلورکتال و سینه و مثانه گزارش شده است (11). در این مطالعه باکتری‌های لاکتیک اسید از مدفوع 60 مراجعه‌کننده به بیمارستان‌های غرب مازندران گردآوری و تعیین هویت شدند. در مطالعات مشخص شده pH معده متغیر است، اما در زمان خالی‌بودن به طور میانگین 4pH دارد و pH روده تا 8 هم گزارش شده است.
در پژوهش Soleimanifard و همکاران (2015) توانایی 79 سویه لاکتوباسیل بومی بررسی شد و پس از توالی‌یابی ژن 16S rRNA چهار سویه برتر به شماره‌های KF735654، KF35655، KJ508201 و KJ508202 در بانک ژنومی مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی ثبت شد. در مطالعه حاضر نیز از میان 50 ایزوله جداسازی‌شده، 7 سویه لاکتوباسیل جداسازی شد که دو سویه به عنوان سویه‌های جدید شناسایی شد و قابلیت ثبت در NCBI را دارد. این سویه‌ها به صورت طبیعی در نمونه‌های مدفوعی نوزادان سالم از نظر گوارشی جداسازی شد. همان‌طور که اشاره شد، لاکتوباسیل‌ها که به صورت فلور طبیعی در انسان دیده می‌شود، در پلاک دندانی و بزاق افراد بزرگسال و در مدفوع نوزادانی که از شیر مادر تغذیه می‌کنند وجود دارد (12).
در مطالعه Melo و همکاران در سال 2017 لاکتوباسیلوس فرمانتوم TCUESC01 در 4-2 pH طی 0- 10 ساعت رشد کمی با 0/1OD600=~ نشان داد، اما با بالارفتن 5< pHو افزایش مدت زمان کشت، افزایش رشد به 0/5< OD600 مشاهده شد (13). در مطالعه Todorov و همکاران در سال 2008 لاکتوباسیلوس رامنوسوس ST461BZ و لاکتوباسیلوس رامنوسوس ST462BZ جداشده از نوشیدنی‌های فرآوری‌شده در بالکان، توان رشد مناسبی در 7-5pH نشان دادند (14). در مطالعه Brink و همکاران در سال 2006 مشخص شد لاکتوباسیلوس پلانتاروم 241 ، لاکتوباسیلوس پلانتاروم 423، لاکتوباسیلوس کورواتوس DF38 و لاکتوکوکوس لاکتیس گونه لاکتیس HV219 توان رشد در 6/5-5 pH را دارند (15). در مطالعه Gupta و Sharmaدر سال 2017 رشد باکتری پروبیوتیک پدیکوکوس اسیدیلاکتیسی Ch-2 در 8-2 pH مشاهده شد (16).
بر اساس نتایج مطالعه حاضر می‌توان انتظار داشت جدایه SE با رشد زیاد در 5-2/5 pH توان تحمل اسید معده را بیشتر از دیگر جدایه‌ها داشته باشد. بنابراین به عنوان یک پروبیوتیک مناسب‌تر می‌تواند مورد توجه قرار گیرد. در مطالعه حاضر جدایه‌های SG، SK و SL در رتبه دوم نسبت به دیگر جدایه‌ها، توان تحمل شرایط بسیار اسیدی معده را نشان دادند که می‌توان انتظار داشت در شرایط بسیار اسیدی معده نیز رشد داشته باشند. این می‌تواند یک مزیت در بررسی این سویه‌ها به عنوان عوامل پروبیوتیک مصرفی باشد.
شرایط محیطی دستگاه گوارش برای رشد بسیاری از باکتری‌ها مناسب است، اما تنش‌های مختلف چون اسیدیته، آنزیم‌های دایجستیو و نمک‌های صفراوی می‌تواند بر بقای باکتری‌ها حین انتقال به روده تأثیر منفی بگذارد (13). در مطالعه Gupta وSharma در سال 2017 پروبیوتیک پدیکوکوس اسیدیلاکتیسی Ch-2 در غلظت نمکی 0/3 درصد صفرا بعد از طی 4 و 8 ساعت مقاومت بالای 95 درصد گزارش شد (16). در مطالعه Leite و همکاران در سال 2015 بر روی 37 سویه پروبیوتیک از جمله لاکتوکوکوس لاکتیس گونه کریموریس، لاکتوکوکوس لاکتیس گونه لاکتیس، لاکتوباسیلوس پاراکازئی و لوکونوستوک مزنتروئیدس مقاومت همه سویه‌ها به غلظت نمکی 0/3 درصد صفرا مشاهده شد (17). در مطالعه Kim و همکاران در سال 2012 بر روی 6 سویه موکئونجی مشخص شد همه سویه‌ها به غیر از سویه G4 تحمل غلظت نمکی 3/0 درصد صفرا را در 12 ساعت بیشتر از 24 ساعت دارند، اما میزان بقای سویه G4 بعد از 24 ساعت در این شرایط نمکی افزایش نشان داد (18). در حالی که در مطالعه حاضر بیشترین رشد سویه SG طی 2 ساعت مشاهده شد و با افزایش مدت زمان کشت در غلظت نمکی 3/0 درصد صفرا، کاهش رشد این سویه رخ داد، اما سویه SE با افزایش زمان به 24 ساعت بهترین رشد را نشان داد. بنابراین انتظار می‌رود سویه SE بیشترین مقاومت را با گذشت زمان به دست می‌آورد، اما استفاده از سویه‌هایی چون سویه SG می‌تواند در صنعت غذایی در مواردی استفاده شود که به مدت زمان کمی برای بقا در دستگاه گوارش نیاز داشته باشند.
لاکتوباسیلوس و بیفیدوباکتر مهم‌ترین باکتری‌های پروبیوتیک هستند که از نظر خواص ضدسرطانی مورد توجه قرار گرفتهاند (19). در مطالعه Choi و همکاران در سال 2006 مشخص شد بخش پلی ساکاریدی سوپرناتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس 606 خواص ضدسرطانی دارد (20). در مطالعه Fichera و همکاران در سال 2016 بخش پپتیدوگلیکان سوپرناتانت لاکتوباسیلوس کازئی اثرات ضدسرطانی بر روی رده‌های سلولی سرطانی خونی انسانی و موشی در شرایط In vitro داشت. در این مطالعه با تأثیر این بخش محلول بر روی موش آلبینوی سوئیسی مشخص شد این ترکیبات اثرات سمی بر روی سلولهای سالم در شرایط In vivo ندارند (21). در این مطالعه تعیین هویت دو جدایه با خواص ضدسرطانی علیه سلولهای سرطانی روده Caco2 (اطلاعات نشان داده نشده است) نشان داد دو جدایه SG و SE به ترتیب از خانواده لاکتوباسیلوس رامنوسوس و لاکتوباسیلوس فرمانتوم هستند. به نظر می‌رسد این دو سویه نیز با آزادکردن ترکیبات خاصی به محیط کشت و یا در شرایط In vivo (در روده) بتوانند باعث مرگ سلولهای سرطانی شوند. در مطالعه Kahouli و همکاران در سال 2013 لاکتوباسیلوس فرمانتوم NCIMB 5221 و لاکتوباسیلوس رامنوسوس ATCC 53103 توان تولید اسید چرب آزاد (FFA) در سوپرناتانت را داشتند. لاکتوباسیلوس فرمنتوم NCIMB 5221 توان تولید اسید چرب زنجیره کوتاه (SCFAs) را داشت، اما در سوپرناتانت لاکتوباسیلوس رامنوسوس ATCC 53103 این ترکیب مشاهده نشد. وجود SCFAs در سوپرناتانت لاکتوباسیلوس فرمنتوم باعث افزایش خاصیت ضدسرطانی این باکتری نسبت به دیگر باکتری‌های مطالعه‌شده بر روی سلولهای سرطانی Caco2 شد (7). بنابراین به نظر می‌رسد گونه‌های لاکتوباسیلوس فرمانتوم از جمله سویه مطالعه‌شده (سویه SE) از طریق تولید ترکیبات ضدسرطانی باعث القای مرگ و کاهش بقای سلولهای سرطانی می‌شوند.
در مطالعه Lam و همکاران در سال 2007 گزارش شد لاکتوباسیلوس رامنوسوس GG قادر به افزایش مخاط معده در رت دارای آسیب مخاطی القاشده با الکل است. در این مطالعه مشخص شد لاکتوباسیلوس رامنوسوس GG باعث افزایش سطح پایه پروستاگلاندین E3ی مخاطی می‌شود و این سویه پروبیوتیک با افزایش پروستاگلاندین E3 مخاطی باعث حفظ سلولهای مخاطی معده از آپوپتوز و مهار سرطان می‌شود (22).
بنابراین می‌توان انتظار داشت لاکتوباسیلوس رامنوسوس (سویه SG) در این مطالعه با ترکیبات خاصی که به محیط ترشح میکند باعث مرگ سلولهای سرطانی شود. همچنین در تأیید این مطلب، مطالعه Escamilla و همکاران در سال 2012 نشان داد سوپرناتانت فاقد سلول از لاکتوباسیلوس رامنوسوس GG و لاکتوباسیلوس کازئی با کاهش میزان متالوپروتئیناز 9 ماتریکس سلولی (MMP-9) باعث کاهش متاستاز سلولهای سرطانی روده HT-29 می‌شود (23). همچنین در مطالعه Linsalata در سال 2010 بر روی رده سرطانی معده HGC-27 مشخص شد لاکتوباسیلوس رامنوسوس GG قادر به کاهش 20 درصدی پلی آمین‌ها (محرک ایجاد سرطان و افزایش تکثیر سلولی) بعد از 48 ساعت است (24). بر این اساس مشخص می‌شود این دو سویه پروبیوتیکی در مطالعه حاضر مشابه با دیگر سویه‌های لاکتوباسیلی از طرق مختلف بتوانند اثرات ضدسرطانی خود را بر سلول‌ها اعمال نمایند که این امر در مطالعات آتی انجام خواهد شد. از محدودیت‌های تحقیق می‌توان به جلب رضایت افراد، هزینه زیاد تحقیق و دسترسی به افراد برای تهیه نمونه اشاره کرد. استفاده از روش‌های مولکولی نیز از نقاط قوت این مطالعه محسوب می‌شود.
این مقاله تحقیقاتی حاصل رساله دکترای تخصصی در رشته میکروبیولوژی است. نویسندگان مقاله از دست‌اندرکاران پژوهش و دانشگاه آزاد اسلامی واحد تنکابن به خاطر همکاری در زمینه ارائه امکانات آزمایشگاهی برای انجام این پایان‌نامه کمال تشکر و قدردانی را دارند.
نویسندگان هیچ‌گونه تعارض منافعی ندارند.
متن کامل: (3731 مشاهده)
مقدمه
استفاده از پروبیوتیک راهکار امیدبخشی برای درمان و جلوگیری از سرطان کلورکتال محسوب می‌شود. پروبیوتیک‌ها میکروارگانیسم‌های زنده‌ای هستند که در مقادیر مشخص می‌توانند در سلامتی میزبان مؤثر باشند (1، 2). در دستگاه گوارش انسان یک مجموعه پیچیده با بیش از 100 تریلیون سلول میکروبی وجود دارد که در فیزیولوژی، تغذیه و متابولیسم انسان تأثیر می‌گذارند. باکتری‌های گوارشی در سنتز ویتامین B و K و متابولیزه‌کردن اسیدهای چرب، استرول‌ها و زنوبیوتیک‌ها نقش دارند (3). با این حال باکتری‌های هم‌سفره، توانایی فعال‌کردن پاسخ ایمنی را نیز دارند. فرستادن سیگنال توسط میکروفلور معده و روده همراه با سد اپی‌تلیالی اولین خط دفاعی دستگاه گوارش علیه پاتوژن‌ها محسوب می‌شود (4). مهم‌ترین سویه‌های پروبیوتیک از باکتری‌های اسید لاکتیکی (LAB) از جنس بیفیدوباکتر و لاکتوباسیلوس هستند (1).
باکتری‌های اسید لاکتیکی (LAB) در ماست، پنیر، شیر، نوشیدنی‌ها، اسموتی‌ها، غلات و ... وجود دارند. بهترین pH برای رشد لاکتوباسیلوس 5- 6/5 است، همچنین تراکم 5 درصد دی‌اکسید کربن تأثیر بسزایی بر رشد آنها دارد. لاکتوباسیلوس‌ها در شرایط بی‌هوازی با حداقل اکسیژن رشد دارند؛ برای مثال در بدن در بزاق دهان، واژن و در محیط تیوگلیکولات از کوکسی به باسیل تغییر می‌کنند. این باکتری‌ها تخمیرکننده هستند و بیشتر محصولات آنها اسید لاکتیک است و خاصیت پروبیوتیکی دارند. مصرف این باکتری‌ها در ترکیبات دارویی توازن طبیعی باکتری و قارچ را در دستگاه گوارش تنظیم میکند. لاکتوباسیل‌ها که به صورت فلور طبیعی در انسان دیده می‌شود عبارتند از: لاکتوباسیلوس بیفیدوس در پلاک دندانی و بزاق افراد بزرگسال و در مدفوع نوزادانی که از شیر مادر تغذیه می‌کنند. مطالعات بر روی مدل‌های حیوانی و جمعیت انسانی نشان داده است مصرف پروبیوتیک‌ها در شرایطی چون تحمل‌نکردن لاکتوز، اسهال القاشده با آنتی‌بیوتیک، التهاب معده و روده، یبوست و عفونت‌های مجاری گوارشی سودمند است (5).
مطالعات مختلف نشان داده است نرخ وقوع (Colorectal Cancer) CRC در افراد سالمی که به طور مرتب از محصولات لبنی تخمیری (حاوی پروبیوتیک) به‌خصوص ماست استفاده می‌کنند، کاهش یافته است (1). به نظر می‌رسد اثرات ضدسرطانی پروبیوتیک‌ها به واسطه تنظیم پاسخ ایمنی، القای اپوپتوز و خواص آنتی‌اکسیدانی آنها باشد. همچنین اثبات شده است روده به طور طبیعی از طریق آنزیم‌های گلیکوزیداز، 𝛽-گلوکورونیداز، آزوردوکتاز و نیتروردوکتاز پیش‌سرطان‌زاها را به سرطان‌زاهای فعال تبدیل میکند. پروبیوتیک‌ها به‌خصوص لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس کازئی سبب کاهش فعالیت این آنزیم‌ها می‌شوند (6). یک ترکیب نامتوازن میکروبی در دستگاه گوارش می‌تواند شرایط را برای کارسینوژنز کولونی مهیا سازد. در حالی که مصرف روزانه سویه‌های خاص پروبیوتیک می‌تواند باعث بازگرداندن توازن میکروبیوتا، سلامتی فرد و مهار کلونی زایی میکروارگانیسم‌های پاتوژن در روده شود (7).
در یک مطالعه نشان داده شد لاکتوباسیلوس رامنوسوس GG اثر مهاری بر روی کارسینوژنز کولونی القاشده با دی متیل هیدارزین (DMH) دارد (8). در یک آزمون بالینی بر روی افراد مبتلا به CRC مصرف خوراکی پروبیوتیک‌ها باعث افزایش تعداد لاکتوباسیلوس، بیفیدوباکتر و انتروکوکوس و کاهش تعداد E.coli و استافیلوکوکوس آئروئوس شد. از سوی دیگر خصوصیات فیزیکوشیمیایی هضم در کولون از جمله pH، ویسکوزیته و میزان اسیدهای صفراوی در موارد مبتلا به CRC دچار تغییر می‌شود. این شرایط محیطی می‌تواند به واسطه پروبیوتیک‌ها تغییر یابد و باعث مقاومت به کارسینوژنز شود (7). با توجه به مطالعات in vitro و in vivo، به نظر می‌رسد پروبیوتیک‌ها توان مهار رشد، پیشرفت و درمان سرطان کلورکتال را داشته باشند (9). با توجه به شواهد آزمایشگاهی و بالینی قوی از تأثیرات مثبت پروبیوتیک‌ها بر سرطان‌زایی کولون، نیاز است تا گونه‌هایی که خاصیت ضدتوموری بیشتری دارند و گونه‌های مختلف از پروبیوتیک‌ها که تأثیرات متفاوتی به عنوان مکمل دارویی در پیشگیری یا درمان سرطان کلورکتال نشان داده‌اند شناسایی شوند. در این مطالعه تلاش شد دو جدایه لاکتوباسیلوس از نظر خصوصیات میکروبی و مولکولی (فیلوژنتیکی) بررسی شود.
مواد و روش‌ها
جداسازی باکتری
در این مطالعه مقطعی و آزمایشگاهی از سال 1395 تا 1396، مطابق با اصول پرسشنامه طراحی‌شده، از مدفوع 60 فرد سالم از نظر گوارشی در بیمارستان‌ها و مراکز درمانی شهر تنکابن نمونه‌گیری شد. سپس نمونه‌ها در دمای 4 درجه سانتی‌گراد تا زمان آزمایش نگهداری شدند. افراد در محدوده سنی 2 ماه تا 40 سال و سالم از نظر گوارشی در این مطالعه وارد و بین آنها افرادی که بیماری گوارشی داشتند از مطالعه خارج شدند. همچنین در این تحقیق تأییدیه کمیته اخلاق از دانشگاه آزاد اسلامی واحد تنکابن به شناسه IR.IAU.TON.REC.1397.032 گرفته شد. جدایه‌ها در محیط کشت MRS (محیط کشت اختصاصی لاکتوباسیل‌ها برگرفته از نام‌های Man Rogosa و Sharpe که در سال 1960 آن را تهیه شده و ترکیبی از گلوکوز، عصاره گوشت و عصاره مخمر همراه با tween 80، منیزیم و منیزم سولفات به عنوان محرک رشد، آمونیوم سیترات و سدیم استات است) گسترده و در دمای ◦C37 به مدت 24 ، 48 و 72 ساعت در شرایط بی هوازی انکوبه شدند. از این تعداد نمونه، 50 ایزوله باکتریایی جداسازی شد. برای تعیین سویه‌های لاکتوباسیلوس تست‌های مختلفی شامل رنگ‌آمیزی گرم، بررسی مورفولوژی، فعالیت کاتالاز، تخمیر کربوهیدرات، تست مقاومت به pH و تست تحمل نمک‌های صفراوی صورت گرفت.
آزمون مقاومت آنتی‌بیوتیکی
مقاومت آنتی‌بیوتیکی جدایه‌ها در محیط MRS براث به روش انتشار از دیسک (Baur-Kirby) و طبق استاندارد CLSI 2013 با استفاده از دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی سفالکسین، سفوکسیم، آموکسی سیلین، آمپی سیلین، پنیسیلین، ونکومایسین، کلیندامایسین، سولفومتاکسازول، ریفامپین، نئومایسین، اریترومایسین، تتراسایکلین، جنتامایسین، کانامایسین، کلرامفنیکل تهیه‌شده از شرکت High Media (هند)، تعیین شد. بعد از 48 ساعت انکوباسیون در جار بی‌هوازی در دمای °C37، قطر هاله عدم رشد اطراف هر دیسک اندازه‌گیری و نتایج آن ثبت شد.
تست حرکت
جدایه‌ها به کمک سوزن (نیدل) در محیط کشت SIM به صورت عمودی در مرکز محیط تا اواسط لوله وارد شد. سپس در یک جار بی‌هوازی به مدت 48 ساعت در دمای ◦C37 انکوبه شد. سپس منفی یا مثبت بودن حرکت بررسی شد.
تست مقاومت به pH
برای تعیین شرایط اسیدی معده، 7 جدایه لاکتوباسیلوس در محیط کشت MRS به مدت 18 ساعت در ◦C37 انکوبه شدند. بعد از تهیه محیط MRS جدید با pHهای 2/5، 3، 3/5، 4، 4/5 و 5، جدایه‌ها به این محیط اضافه و به مدت 24 تا 48 ساعت در ◦C37 انکوبه شدند. سپس نتایج کشت نسبت به کدورت نیم مک فارلند بررسی شد. برای مقایسه میزان مقاومت جدایه‌ها در pHهای مختلف از آزمون کروسکال والیس استفاده شد.
تست تحمل نمک‌های صفراوی
محلول نمک صفراوی دزوکسی کولات با غلظت 0/3 درصد به 100 میکرولیتر محیط MRS اضافه و 100 میکرولیتر از جدایه‌ها به طور جداگانه به این محیط اضافه و در جار بی‌هوازی در دمای ◦C37 انکوبه شد. میزان جذب نوری جدایه‌ها در زمان‌های صفر، 30 دقیقه، 2 ساعت، 4 ساعت و 24 ساعت بعد از تلقیح، با دستگاه اسپکتوفتومتر و طول موج 600 نانومتر خوانده شد. از محیط کشت فاقد باکتری به عنوان نمونه بلانک استفاده شد.
آنالیز مولکولی جدایه‌های لاکتوباسیلوس
به منظور تأیید مولکولی ایزوله‌های جداسازی‌شده به عنوان سویه پروبیوتیک، ابتدا استخراج DNA با استفاده از کیت High Pure-Template PCR preparation (شرکت Roche، سوئیس) صورت گرفت. سپس تکثیر ژن 16s rRNA به روش PCR و با استفاده از مستر میکس (Amplcon، دانمارک) با غلظت 12/5 ماکرولیتر، DNA با غلظت 5 ماکرولیتر در حجم نهایی 25 ماکرولیتر، در ترمال سایکلر ABI2720 طبق برنامه ذیل انجام شد: یک مرحله واسرشت‌شدن ابتدایی در °C95 به مدت 5 دقیقه، 35 سیکل در دمای °C95 به مدت 1 دقیقه، °C60 به مدت 1 دقیقه، °C72 به مدت 75 ثانیه و یک مرحله گسترش نهایی در دمای °C72 به مدت 10 دقیقه. در این مطالعه از پرایمرهای فراگیر (جهانی) با غلظت 0/5 ماکرولیتر و با توالی زیر استفاده شد: پرایمر مستقیم 5'-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3' و پرایمر برگشتی 5'-TACGGTACCTTGTTACGACTT-3' (10). بعد از اطمینان از تک‌باند بودن محصولات PCR، نمونه‌ها با حفظ زنجیره سرمایی به منظور تعیین توالی به شرکت ماکروژن کشور کره جنوبی فرستاده شد. نتایج حاصل به کمک نرمافزار CLC Main Workbench v3.5 و نرمافزار آنلاین بلاست (BLAST) خوانش و با نرمافزار Mega7 از نظر قرابت ژنتیکی ارزیابی شد.
آنالیز اماری
در این مطالعه از آزمون کلموگروف-اسمیرنوف، آزمون تحلیل واریانس و آزمون تعقیبی توکی استفاده شد. داده‌ها بصورت میانگین±انحراف معیار نشان داده شد.
یافته‌ها
تحلیل آزمون‌های میکروب‌شناسی
در این مطالعه هفت باسیل با ویژگی‌های کاتالاز منفی و گرم مثبت تعیین شدند که در تست حرکت، منفی بودند. نتایج آنتی‌بیوگرام 7 جدایه لاکتوباسیل که به صورت کدگذاری‌شده، نام‌گذاری شدند، در جدول 1 نشان داده شده است. بر اساس نتایج آنتی‌بیوگرام مشخص شد هر 7 جدایه به جنتامایسین، نئومایسین، سولفومتاکسازول و کانامایسین مقاوم بودند. همچنین 5 جدایه به ونکومایسین مقاومت نشان دادند. در حالی که همه جدایه‌ها به آموکسی‌سیلین، آمپی‌سیلین، تتراسایکلین، پنیسیلین و کلرامفنیکل حساس بودند.
جدول 1. الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیکی و قطر هاله در جدایه‌های مختلف لاکتوباسیلوس
| SN5 | SN3 | SO | SK | SL | SE | SG | جدایه آنتی‌بیوتیک |
| 8 R |
8 R |
0 R |
24 S |
0 R |
17 S |
26 S |
سفالکسین |
| 10 R |
10 R |
35 S |
36 S |
32 S |
36 S |
34 S |
کلیندامایسین |
| 21 S |
21 S |
30 S |
32 S |
26 S |
36 S |
37 S |
آموکسی‌سیلین |
| 21 S |
20 S |
0 R |
0 R |
0 R |
0 R |
0 R |
ونکومایسین |
| 0 R |
0 R |
0 R |
20 I |
0 R |
13 I |
18 I |
سفکسیم |
| 21 S |
21 S |
26 S |
36 S |
25 S |
37 S |
35 S |
آمپی‌سیلین |
| 0 R |
0 R |
0 R |
0 R |
0 R |
0 R |
0 R |
سولفامتاکسازول |
| 25 S |
28 S |
35 S |
30 S |
32 S |
25 S |
28 S |
تتراسایکلین |
| 19 S |
18 S |
36 S |
42 S |
34 S |
47 S |
44 S |
پنیسیلین |
| 0 R |
0 R |
0 R |
0 R |
0 R |
0 R |
0 R |
کانامایسین |
| 15 I |
28 S |
47 S |
32 S |
37 S |
35 S |
36 S |
اریترومایسین |
| 8 R |
8 R |
15 S |
12 R |
11 R |
11 R |
12 R |
جنتامایسین |
| 25 S |
24 S |
35 S |
35 S |
30 S |
32 S |
33 S |
کلرامفنیکل |
| 10 R |
10 R |
11 R |
15 R |
15 R |
14 R |
13 R |
نئومایسین |
| 13 R |
13 R |
35 S |
34 S |
31 S |
31 S |
32 S |
ریفامپین |
R: Resistance; S: Susceptible; I: Intermediate
نتایج مقاومت به pH های مختلف در 7 جدایه به صورت 3 درجه از رشد (1: رشد ضعیف، 2: رشد خوب و 3: رشد عالی) در جدول 2 نشان داده شده است. به طوری که جدایه‌های SG و SN5 در 3/5≤ pH، جدایه SE در همه pHها، جدایه SK در 3≤ pH، جدایه SL ، SO و SN3در 4≤ pH رشد عالی داشتند که نشان‌دهنده مقاومت آنها به pH های مختلف بود.
جدول 2. نتایج آزمون کروسکال والیس مقایسه میزان مقاومت جدایه‌ها بر حسب pH
| مقدار ارزش P | 5 | 4/5 | 4 | 3/5 | 3 | 2/5 | pH جدایه |
| 0/574 | 3 ± 1 | 3 ± 1 | 3 ± 1 | 3 ± 1 | 2 ± 1 | 2 ± 1 | SG |
| 1 | 3 ± 1 | 3 ± 1 | 3 ± 1 | 3 ± 1 | 3 ± 1 | 3 ± 1 | SE |
| 0/789 | 3 ± 1 | 3 ± 1 | 3 ± 1 | 3 ± 1 | 3 ± 1 | 2 ± 1 | SK |
| 0/551 | 3 ± 1 | 3 ± 1 | 3 ± 1 | 2 ± 1 | 0/577 ± 2/33 | 2 ± 1 | SL |
| 0/201 | 3 ± 1 | 3 ± 1 | 3 ± 1 | 2± 1 | 2± 1 | 1± 1 | SO |
| 0/201 | 3 ± 1 | 3 ± 1 | 3 ± 1 | 2 ± 1 | 2 ± 1 | 1 ± 1 | SN3 |
| 0/220 | 3 ± 1 | 3 ± 1 | 3 ± 1 | 3 ± 1 | 2 ± 1 | 1 ± 1 | SN5 |
میزان جذب نوری در جدایه‌ها نشان داد جدایه‌ها توان تحمل نمک‌های صفراوی را دارند و تفاوت حاصل از رشد آنها به کمک آزمون تعقیبی توکی در ساعات مختلف تفاوت معنی‌داری (P-Value<0.05) را نشان داد (جدول 3). به طوری که بیشترین میزان جذب نوری برای جدایه SG، دو ساعت بعد از تیمار با اسید صفراوی گزارش شد که میزان آن با دیگر ساعات تیمار تفاوت معناداری را نشان داد. در جدایه‌های SE ، SK ، SL و SN5 بیشترین میزان جذب مربوط به زمان 24 ساعت بود که با میزان جذب در بقیه زمان‌ها تفاوت معناداری داشت. در جدایه SO بیشترین میزان جذب نوری مربوط به زمان‌های 2، 4 و 24 ساعت گزارش شد. در جدایه SN3 ، بیشترین و کمترین میزان جذب نوری به ترتیب مربوط به 4 ساعت و 2 ساعت بود.
جدول 3. نتایج آزمون تحلیل واریانس مقایسه میزان جذب جدایه‌ها بر حسب زمان
| P | 24h | 4h | 2h | 30 min | 0 | زمان جدایه |
| <0.05 | 0/063 ± 0/003 | 0/045± 0/060 | 0/163 ± 0/004 | 0/093± 0/004 | 0/055 ± 0/003 | SG |
| <0.05 | 0/249 ± 0/003 | 0/070 ± 0/003 | 0/082 ± 0/003 | 0/076 ± 0/003 | 0/086 ± 0/003 | SE |
| <0.05 | 0/255 ± 0/003 | 0/154 ± 0/003 | 0/158 ± 0/003 | 0/112 ± 0/004 | 0/121 ± 0/004 | SK |
| <0.05 | 1/073 ± 0/035 | 0/241 ± 0/397 | 0/125 ± 0/004 | 0/073 ± 0/004 | 0/124 ± 0/004 | SL |
| <0.05 | 0/991 ± 0/003 | 0/797 ± 0/004 | 0/847 ± 0/035 | 0/004 ± 0/003 | 0/233 ± 0/153 | SO |
| <0.05 | 0/444 ± 0/003 | 0/487 ± 0/005 | 0/061 ± 0/003 | 0/078 ± 0/003 | 0/085 ± 0/003 | SN3 |
| <0.05 | 0/992 ± 0/003 | 0/153 ± 0/035 | 0/107 ± 0/004 | 0/024 ± 0/003 | 0/204 ± 0/004 | SN5 |
نتایج مربوط به تخمیر 15 قند (جدول 4) برای دو جدایه SG و SE نشان داد جدایه SG قادر به تخمیر 9 قند از جمله لاکتوز بود؛ اما SE قادر به تخمیر 10 قند بود که فروکتوز شامل آنها نمی‌شد.
جدول 4. نتایج تست تخمیر قندهای لاکتوباسیل های جدایه با قابلیت‌های پروبیوتیکی
آنالیز مولکولی
نتایج آنالیز توالی ژن 16s rRNA نشان داد جدایه‌های SG و SL از نوع لاکتوباسیلوس رامنوسوس، جدایه‌های SE وSK از نوع لاکتوباسیلوس فرمانتوم، جدایه‌های SO و SN5از نوع انتروکوکوس فاسیوم و جدایه SN3 از نوع انتروکوکوس دورانس است. همچنین در بررسی فیلوژنی هفت جدایه بررسی‌شده مشخص شد جدایه SE با سویه‌های لاکتوباسیلوس فرمانتوم حدود 86 درصد قرابت ژنتیکی دارد و بر اساس درصد قرابت داخل درخت فیلوژنی، به نظر می‌رسد جدایه SE یک سویه جدید از لاکتوباسیلوس فرمانتوم در استان مازندران باشد (شکل 1). همچنین جدایه SG با سویه‌های L10 و L15 لاکتوباسیلوس رامنوسوس 61 درصد قرابت ژنتیکی نشان داد (شکل 2)، که بر اساس درصد قرابت داخل درخت فیلوژنی، جدایه SG نیز احتمالاً یک سویه جدید از لاکتوباسیلوس رامنوسوس باشد. جدایه SL قرابت کم 16 درصد به گونه لاکتوباسیلوس رامنوسوس و لاکتوباسیلوس فرمانتوم داشت (شکل 3). جدایه‌های SO و SN با سویه‌های انتروکوکوس فاسیوم حدود 99 درصد قرابت ژنتیکی داشتند که بر اساس آنالیز فیلوژنیک به عنوان یک سویه جدید انتروکوکوس فاسیوم معرفی می‌شود (شکل 4).
شکل 1. تصویر درخت فیلوژنی SE. به این منظور توالی ژن 16s rRNA در سویه مدنظر تعیین توالی و قرابت آن با سویه‌های دیگر بررسی شد.
شکل 2. تصویر درخت فیلوژنی SG. به این منظور توالی ژن 16s rRNA در سویه مدنظر تعیین توالی و قرابت آن با سویه‌های دیگر بررسی شد.
شکل 3. تصویر درخت فیلوژنی SL. به این منظور توالی ژن 16s rRNA در سویه مدنظر تعیین توالی و قرابت آن با سویه‌های دیگر بررسی شد.
شکل 4. تصویر درخت فیلوژنی SO و SN. به این منظور توالی ژن 16s rRNA در سویه مدنظر تعیین توالی و قرابت آن با سویه‌های دیگر بررسی شد.
بحث و نتیجه‌گیری
پروبیوتیک‌ها به عنوان مکمل‌های میکروبی غذایی با توان حفظ توازن میکروبی در دستگاه گوارش می‌توانند نقش مؤثری در حفظ سلامتی میزبان داشته باشند. اثرات ضدسرطانی پروبیوتیک‌ها از گونه‌های لاکتوباسیلوس، بیفیدوباکتر و انتروکوک در مطالعات مختلف در سرطان کلورکتال و سینه و مثانه گزارش شده است (11). در این مطالعه باکتری‌های لاکتیک اسید از مدفوع 60 مراجعه‌کننده به بیمارستان‌های غرب مازندران گردآوری و تعیین هویت شدند. در مطالعات مشخص شده pH معده متغیر است، اما در زمان خالی‌بودن به طور میانگین 4pH دارد و pH روده تا 8 هم گزارش شده است.
در پژوهش Soleimanifard و همکاران (2015) توانایی 79 سویه لاکتوباسیل بومی بررسی شد و پس از توالی‌یابی ژن 16S rRNA چهار سویه برتر به شماره‌های KF735654، KF35655، KJ508201 و KJ508202 در بانک ژنومی مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی ثبت شد. در مطالعه حاضر نیز از میان 50 ایزوله جداسازی‌شده، 7 سویه لاکتوباسیل جداسازی شد که دو سویه به عنوان سویه‌های جدید شناسایی شد و قابلیت ثبت در NCBI را دارد. این سویه‌ها به صورت طبیعی در نمونه‌های مدفوعی نوزادان سالم از نظر گوارشی جداسازی شد. همان‌طور که اشاره شد، لاکتوباسیل‌ها که به صورت فلور طبیعی در انسان دیده می‌شود، در پلاک دندانی و بزاق افراد بزرگسال و در مدفوع نوزادانی که از شیر مادر تغذیه می‌کنند وجود دارد (12).
در مطالعه Melo و همکاران در سال 2017 لاکتوباسیلوس فرمانتوم TCUESC01 در 4-2 pH طی 0- 10 ساعت رشد کمی با 0/1OD600=~ نشان داد، اما با بالارفتن 5< pHو افزایش مدت زمان کشت، افزایش رشد به 0/5< OD600 مشاهده شد (13). در مطالعه Todorov و همکاران در سال 2008 لاکتوباسیلوس رامنوسوس ST461BZ و لاکتوباسیلوس رامنوسوس ST462BZ جداشده از نوشیدنی‌های فرآوری‌شده در بالکان، توان رشد مناسبی در 7-5pH نشان دادند (14). در مطالعه Brink و همکاران در سال 2006 مشخص شد لاکتوباسیلوس پلانتاروم 241 ، لاکتوباسیلوس پلانتاروم 423، لاکتوباسیلوس کورواتوس DF38 و لاکتوکوکوس لاکتیس گونه لاکتیس HV219 توان رشد در 6/5-5 pH را دارند (15). در مطالعه Gupta و Sharmaدر سال 2017 رشد باکتری پروبیوتیک پدیکوکوس اسیدیلاکتیسی Ch-2 در 8-2 pH مشاهده شد (16).
بر اساس نتایج مطالعه حاضر می‌توان انتظار داشت جدایه SE با رشد زیاد در 5-2/5 pH توان تحمل اسید معده را بیشتر از دیگر جدایه‌ها داشته باشد. بنابراین به عنوان یک پروبیوتیک مناسب‌تر می‌تواند مورد توجه قرار گیرد. در مطالعه حاضر جدایه‌های SG، SK و SL در رتبه دوم نسبت به دیگر جدایه‌ها، توان تحمل شرایط بسیار اسیدی معده را نشان دادند که می‌توان انتظار داشت در شرایط بسیار اسیدی معده نیز رشد داشته باشند. این می‌تواند یک مزیت در بررسی این سویه‌ها به عنوان عوامل پروبیوتیک مصرفی باشد.
شرایط محیطی دستگاه گوارش برای رشد بسیاری از باکتری‌ها مناسب است، اما تنش‌های مختلف چون اسیدیته، آنزیم‌های دایجستیو و نمک‌های صفراوی می‌تواند بر بقای باکتری‌ها حین انتقال به روده تأثیر منفی بگذارد (13). در مطالعه Gupta وSharma در سال 2017 پروبیوتیک پدیکوکوس اسیدیلاکتیسی Ch-2 در غلظت نمکی 0/3 درصد صفرا بعد از طی 4 و 8 ساعت مقاومت بالای 95 درصد گزارش شد (16). در مطالعه Leite و همکاران در سال 2015 بر روی 37 سویه پروبیوتیک از جمله لاکتوکوکوس لاکتیس گونه کریموریس، لاکتوکوکوس لاکتیس گونه لاکتیس، لاکتوباسیلوس پاراکازئی و لوکونوستوک مزنتروئیدس مقاومت همه سویه‌ها به غلظت نمکی 0/3 درصد صفرا مشاهده شد (17). در مطالعه Kim و همکاران در سال 2012 بر روی 6 سویه موکئونجی مشخص شد همه سویه‌ها به غیر از سویه G4 تحمل غلظت نمکی 3/0 درصد صفرا را در 12 ساعت بیشتر از 24 ساعت دارند، اما میزان بقای سویه G4 بعد از 24 ساعت در این شرایط نمکی افزایش نشان داد (18). در حالی که در مطالعه حاضر بیشترین رشد سویه SG طی 2 ساعت مشاهده شد و با افزایش مدت زمان کشت در غلظت نمکی 3/0 درصد صفرا، کاهش رشد این سویه رخ داد، اما سویه SE با افزایش زمان به 24 ساعت بهترین رشد را نشان داد. بنابراین انتظار می‌رود سویه SE بیشترین مقاومت را با گذشت زمان به دست می‌آورد، اما استفاده از سویه‌هایی چون سویه SG می‌تواند در صنعت غذایی در مواردی استفاده شود که به مدت زمان کمی برای بقا در دستگاه گوارش نیاز داشته باشند.
لاکتوباسیلوس و بیفیدوباکتر مهم‌ترین باکتری‌های پروبیوتیک هستند که از نظر خواص ضدسرطانی مورد توجه قرار گرفتهاند (19). در مطالعه Choi و همکاران در سال 2006 مشخص شد بخش پلی ساکاریدی سوپرناتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس 606 خواص ضدسرطانی دارد (20). در مطالعه Fichera و همکاران در سال 2016 بخش پپتیدوگلیکان سوپرناتانت لاکتوباسیلوس کازئی اثرات ضدسرطانی بر روی رده‌های سلولی سرطانی خونی انسانی و موشی در شرایط In vitro داشت. در این مطالعه با تأثیر این بخش محلول بر روی موش آلبینوی سوئیسی مشخص شد این ترکیبات اثرات سمی بر روی سلولهای سالم در شرایط In vivo ندارند (21). در این مطالعه تعیین هویت دو جدایه با خواص ضدسرطانی علیه سلولهای سرطانی روده Caco2 (اطلاعات نشان داده نشده است) نشان داد دو جدایه SG و SE به ترتیب از خانواده لاکتوباسیلوس رامنوسوس و لاکتوباسیلوس فرمانتوم هستند. به نظر می‌رسد این دو سویه نیز با آزادکردن ترکیبات خاصی به محیط کشت و یا در شرایط In vivo (در روده) بتوانند باعث مرگ سلولهای سرطانی شوند. در مطالعه Kahouli و همکاران در سال 2013 لاکتوباسیلوس فرمانتوم NCIMB 5221 و لاکتوباسیلوس رامنوسوس ATCC 53103 توان تولید اسید چرب آزاد (FFA) در سوپرناتانت را داشتند. لاکتوباسیلوس فرمنتوم NCIMB 5221 توان تولید اسید چرب زنجیره کوتاه (SCFAs) را داشت، اما در سوپرناتانت لاکتوباسیلوس رامنوسوس ATCC 53103 این ترکیب مشاهده نشد. وجود SCFAs در سوپرناتانت لاکتوباسیلوس فرمنتوم باعث افزایش خاصیت ضدسرطانی این باکتری نسبت به دیگر باکتری‌های مطالعه‌شده بر روی سلولهای سرطانی Caco2 شد (7). بنابراین به نظر می‌رسد گونه‌های لاکتوباسیلوس فرمانتوم از جمله سویه مطالعه‌شده (سویه SE) از طریق تولید ترکیبات ضدسرطانی باعث القای مرگ و کاهش بقای سلولهای سرطانی می‌شوند.
در مطالعه Lam و همکاران در سال 2007 گزارش شد لاکتوباسیلوس رامنوسوس GG قادر به افزایش مخاط معده در رت دارای آسیب مخاطی القاشده با الکل است. در این مطالعه مشخص شد لاکتوباسیلوس رامنوسوس GG باعث افزایش سطح پایه پروستاگلاندین E3ی مخاطی می‌شود و این سویه پروبیوتیک با افزایش پروستاگلاندین E3 مخاطی باعث حفظ سلولهای مخاطی معده از آپوپتوز و مهار سرطان می‌شود (22).
بنابراین می‌توان انتظار داشت لاکتوباسیلوس رامنوسوس (سویه SG) در این مطالعه با ترکیبات خاصی که به محیط ترشح میکند باعث مرگ سلولهای سرطانی شود. همچنین در تأیید این مطلب، مطالعه Escamilla و همکاران در سال 2012 نشان داد سوپرناتانت فاقد سلول از لاکتوباسیلوس رامنوسوس GG و لاکتوباسیلوس کازئی با کاهش میزان متالوپروتئیناز 9 ماتریکس سلولی (MMP-9) باعث کاهش متاستاز سلولهای سرطانی روده HT-29 می‌شود (23). همچنین در مطالعه Linsalata در سال 2010 بر روی رده سرطانی معده HGC-27 مشخص شد لاکتوباسیلوس رامنوسوس GG قادر به کاهش 20 درصدی پلی آمین‌ها (محرک ایجاد سرطان و افزایش تکثیر سلولی) بعد از 48 ساعت است (24). بر این اساس مشخص می‌شود این دو سویه پروبیوتیکی در مطالعه حاضر مشابه با دیگر سویه‌های لاکتوباسیلی از طرق مختلف بتوانند اثرات ضدسرطانی خود را بر سلول‌ها اعمال نمایند که این امر در مطالعات آتی انجام خواهد شد. از محدودیت‌های تحقیق می‌توان به جلب رضایت افراد، هزینه زیاد تحقیق و دسترسی به افراد برای تهیه نمونه اشاره کرد. استفاده از روش‌های مولکولی نیز از نقاط قوت این مطالعه محسوب می‌شود.
سپاسگزاری
این مقاله تحقیقاتی حاصل رساله دکترای تخصصی در رشته میکروبیولوژی است. نویسندگان مقاله از دست‌اندرکاران پژوهش و دانشگاه آزاد اسلامی واحد تنکابن به خاطر همکاری در زمینه ارائه امکانات آزمایشگاهی برای انجام این پایان‌نامه کمال تشکر و قدردانی را دارند.
تعارض منافع
نویسندگان هیچ‌گونه تعارض منافعی ندارند.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشی |
موضوع مقاله:
میکروب شناسی مولکولی
دریافت: 1397/12/3 | پذیرش: 1398/2/21 | انتشار الکترونیک: 1398/4/31
دریافت: 1397/12/3 | پذیرش: 1398/2/21 | انتشار الکترونیک: 1398/4/31
فهرست منابع
1. Jacouton E, Chain F, Sokol H, Langella P, Bermudez-Humaran LG. Probiotic Strain Lactobacillus Casei BL23 Prevents Colitis-Associated Colorectal Cancer. Frontiers in Immunology. 2017; 8:1553. [DOI:10.3389/fimmu.2017.01553] [PMID] [PMCID]
2. Mattar MC, Lough D, Pishvaian MJ, Charabaty A. Current Management of Inflammatory Bowel Disease and Colorectal Cancer. Gastrointestinal Cancer Research: GCR. 2011; 4(2):53-61.
3. Ciernikova S, Mego M, Semanova M, Wachsmannova L, Adamcikova Z, Stevurkova V, et al. Probiotic Survey in Cancer Patients Treated in the Outpatient Department in a Comprehensive Cancer Center. Integrative Cancer Therapies. 2017; 16(2):188-195. [DOI:10.1177/1534735416643828] [PMID] [PMCID]
4. Goto Y, Kiyono H. Epithelial Barrier: An Interface for the Cross-Communication Between Gut Flora and Immune System. Immunological Reviews. 2012; 245(1):147-163. [DOI:10.1111/j.1600-065X.2011.01078.x] [PMID]
5. Uccello M, Malaguarnera G, Basile F, D'Agata V, Malaguarnera M, Bertino G, et al. Potential Role of Probiotics on Colorectal Cancer Prevention. BMC Surgery. 2012; 12 Suppl 1:S35. [DOI:10.1186/1471-2482-12-S1-S35] [PMID] [PMCID]
6. Zhong L, Zhang X, Covasa M. Emerging Roles of Lactic Acid Bacteria in Protection Against Colorectal Cancer. World Journal of Gastroenterology. 2014; 20(24):7878-7886. [DOI:10.3748/wjg.v20.i24.7878] [PMID] [PMCID]
7. Kahouli I, Tomaro-Duchesneau C, Prakash S. Probiotics in Colorectal Cancer (CRC) With Emphasis on Mechanisms of Action and Current Perspectives. Journal of Medical Microbiology. 2013; 62(Pt 8):1107-1123. [DOI:10.1099/jmm.0.048975-0] [PMID]
8. Bertkova I, Hijova E, Chmelarova A, Mojzisova G, Petrasova D, Strojny L, et al. The Effect of Probiotic Microorganisms and Bioactive Compounds on Chemically Induced Carcinogenesis in Rats. Neoplasma. 2010; 57(5):422-428. [DOI:10.4149/neo_2010_05_422] [PMID]
9. Hendler R, Zhang Y. Probiotics in the Treatment of Colorectal Cancer. Medicines (Basel). 2018; 5(3). [DOI:10.3390/medicines5030101] [PMID] [PMCID]
10. Turner S, Pryer KM, Miao VP, Palmer JD. Investigating Deep Phylogenetic Relationships Among Cyanobacteria and Plastids by Small Subunit rRNA Sequence Analysis 1. Journal of Eukaryotic Microbiology. 1999; 46(4):327-338. [DOI:10.1111/j.1550-7408.1999.tb04612.x] [PMID]
11. Raman M, Ambalam P, Kondepudi KK, Pithva S, Kothari C, Patel AT, et al. Potential of Probiotics, Prebiotics and Synbiotics for Management of Colorectal Cancer. Gut Microbes. 2013; 4(3):181-192. [DOI:10.4161/gmic.23919] [PMID] [PMCID]
12. Soleimani Ff, Ghobadi DM, Piravivanak Z. Screening Local Lactobacilli From Iran in Terms of Production of Lactic Acid and Identification of Superior Strains. Biological Journal of Microorganism. 2015; 4(15):155-166.
13. Melo TA, Dos Santos TF, Pereira LR, Passos HM, Rezende RP, Romano CC. Functional Profile Evaluation of Lactobacillus fermentum TCUESC01: A New Potential Probiotic Strain Isolated during Cocoa Fermentation. BioMed Research International. 2017; 2017:5165916. [DOI:10.1155/2017/5165916] [PMID] [PMCID]
14. Todorov SD, Botes M, Guigas C, Schillinger U, Wiid I, Wachsman MB, et al. Boza, A Natural Source of Probiotic Lactic Acid Bacteria. Journal of Applied Microbiology. 2008; 104(2):465-477.
15. Brink M, Todorov SD, Martin JH, Senekal M, Dicks LM. The Effect of Prebiotics on Production of Antimicrobial Compounds, Resistance to Growth at Low pH and in the Presence of Bile, and Adhesion of Probiotic Cells to Intestinal Mucus. Journal of Applied Microbiology. 2006; 100(4):813-820. [DOI:10.1111/j.1365-2672.2006.02859.x] [PMID]
16. Gupta A SN. Characterization of Potential Probiotic Lactic Acid Bacteria- Pediococcus acidilactici Ch-2 Isolated from Chuli: A Traditional Apricot Product of Himalayan Region for the Production of Novel Bioactive Compounds with Special Therapeutic Properties. J Food Microbiol Saf Hyg. 2017; 2(1):1-11. [DOI:10.4172/2476-2059.1000119]
17. Leite AM, Miguel MA, Peixoto RS, Ruas-Madiedo P, Paschoalin VM, Mayo B, et al. Probiotic Potential of Selected Lactic Acid Bacteria Strains Isolated From Brazilian Kefir Grains. Journal of Dairy Science. 2015; 98(6):3622-3632. [DOI:10.3168/jds.2014-9265] [PMID]
18. Kim SE, Kim YH, Lee H, Kim DO, Kim HY. Probiotic Properties of Lactic Acid Bacteria Isolated From Mukeunji, A Long-Term Ripened Kimchi. Food Science and Biotechnology. 2012; 21(4):1135-1140. [DOI:10.1007/s10068-012-0148-4]
19. Wang SM, Zhang LW, Fan RB, Han X, Yi HX, Zhang LL, et al. Induction of HT-29 Cells Apoptosis by Lactobacilli Isolated From Fermented Products. Research in Microbiology. 2014; 165(3):202-214. [DOI:10.1016/j.resmic.2014.02.004] [PMID]
20. Choi SS, Kim Y, Han KS, You S, Oh S, Kim SH. Effects of Lactobacillus Strains on Cancer Cell Proliferation and Oxidative Stress In Vitro. Letters in Applied Microbiology. 2006; 42(5):452-458. [DOI:10.1111/j.1472-765X.2006.01913.x] [PMID]
21. Fichera GA, Fichera M, Milone G. Antitumoural Activity of a Cytotoxic Peptide of Lactobacillus Casei Peptidoglycan and Its Interaction With Mitochondrial-Bound Hexokinase. Anti-Cancer Drugs. 2016; 27(7):609-619. [DOI:10.1097/CAD.0000000000000367] [PMID] [PMCID]
22. Lam EK, Tai EK, Koo MW, Wong HP, Wu WK, Yu L, et al. Enhancement of Gastric Mucosal Integrity by Lactobacillus Rhamnosus GG. Life Sciences. 2007; 80(23):2128-2136. [DOI:10.1016/j.lfs.2007.03.018] [PMID]
23. Escamilla J, Lane MA, Maitin V. Cell-Free Supernatants From Probiotic Lactobacillus Casei and Lactobacillus Rhamnosus GG Decrease Colon Cancer Cell Invasion In Vitro. Nutrition and Cancer. 2012; 64(6):871-678. [DOI:10.1080/01635581.2012.700758] [PMID]
24. Linsalata M, Cavallini A, Messa C, Orlando A, Refolo MG, Russo F. Lactobacillus Rhamnosus GG Influences Polyamine Metabolism in HGC-27 Gastric Cancer Cell Line: A Strategy Toward Nutritional Approach to Chemoprevention of Gastric Cancer. Current Pharmaceutical Design. 2010; 16(7):847-853. [DOI:10.2174/138161210790883598] [PMID]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
