fa طراحی بیوانفورماتیکی و ساخت ژن کایمر دربردارنده زیر واحد B کلراتوکسین و زیر واحد A پیلی ویبریو کلرا میکروب شناسی مولکولی Molecular Microbiology مقاله پژوهشی Original Research Article <p dir="RTL" style="text-align: justify;"><span style="font-size:12px;"><span style="font-family:tahoma;"><strong>زمینه و اهداف:</strong> وبا بیماری خطرناکی است که توسط <em>ویبریو کلرا</em> ایجاد می‌شود. فاکتور کلونیزاسیون پیلی <span dir="LTR">Toxin-coregulated pili A (<em>tcpA</em>)</span> و توکسین کلرا مهم‌ترین عوامل بیماری‌زایی <em>ویبریوکلرا </em>می‌باشند. زیر واحد <span dir="LTR">B</span> انتروتوکسین <span dir="LTR">&nbsp;Cholera toxin subunit B (<em>ctxB</em>)</span>مسئول اتصال سم به سلول یوکاریوتی است و&nbsp;<em><span dir="LTR">tcpA</span></em> که برای کلونیزاسیون باکتری ضروری است، ویژگی‌های ایمونوژنیک دارند. پروتئین‌های کایمر دربردارنده اپی توپ و ادجوانت، می‌توانند سبب افزایش خاصیت ایمونوژنیسیتی پروتئین‌ها شوند و سبب بروز پاسخ‌های ایمنی گردند. هدف از تحقیق طراحی ایمنوژن کایمر علیه فاکتورهای اتصال و توکسین <em>ویبریو کلرا</em> بود.<br> <strong>مواد و روش کار: </strong>ژن <em><span dir="LTR">ctxB</span></em> و <em><span dir="LTR">tcpA</span></em> به لحاظ وجود کدون‌های نادر&nbsp; در سال 95 مورد بررسی قرار گرفتند و بهینه‌سازی ژن‌ها انجام شد. نیمه‌عمر و شاخص ناپایداری پروتئین تعیین گردید. ساختارهای دوم و سوم پروتئین پیش‌بینی و ارزیابی شد. اپی توپ‌های خطی و فضایی نیز تعیین گردید. پلاسیمد نوترکیب به سلول‌های مستعد منتقل و بیان پروتئین با استفاده از &nbsp;<span dir="LTR">IPTG</span> القا گردید. بیان پروتئین با روش <span dir="LTR">SDS-PAGE</span> وسترن بلاتینگ ارزیابی شد.<br> <strong>یافته‌ها: </strong>شاخص ناپایداری پروتئین کایمر 24/04 بود. شاخص سازگاری کدون سازه کایمر به 0/9 افزایش یافت. ساختار سوم پیش‌بینی‌شده نیز کیفیت مناسبی را داشت و <span dir="LTR">mRNA</span> آن نیز پایدار بود. اپی توپ‌های فضایی و خطی در هر دو دومین پروتئین کایمر دیده شد. آنالیز همسانه سازی، پلاسمید نوترکیب واجد ژن کایمر را تائید کرد. بیان پروتئین نوترکیب از ژن سنتزی منجر به تولید پروتئینی با وزن 37 کیلو دالتون شد.<br> <strong>نتیجه‌گیری</strong><strong><span dir="LTR">:</span></strong> با توجه به نتایج بررسی‌های بیوانفورماتیکی و بیان پروتئین نوترکیب می‌توان از آن به‌عنوان ایمونوژن جهت بررسی‌های ایمنی علیه وبا استفاده شود<span dir="LTR">.</span></span></span><br> &nbsp;</p> <p></p> <p></p> <p dir="ltr" style="text-align: justify;"><strong>Background and Aims: </strong>Cholera is a lethal diarrheal disease that cause by <em>Vibrio</em> <em>cholerae</em>. Cholera toxin and colonization factor pili <em>(tcpA</em>) are the major virulence factor in <em>V.cholerae </em>pathogenesis. The B subunit of the enterotoxin <strong><span dir="RTL">)</span></strong><em>ctxB</em>) which is responsible for toxin binding to eukaryotic cells and toxin-coregulated pili A (<em>tcpA</em>) that is essential for <em>V.cholerae </em>colonization, have immunogenic properties. Chimeric proteins carrying epitopes, linkers or adjuvant sequences could increase immunogenicity for recombinant antigens and can also elicit broad immune responses. The aim of this study was to design am immunogen against adherence and toxicity of <em>V.cholorae.</em><br> <strong>Materials and Methods: </strong><em>ctxB</em> and <em>tcpA</em> genes were analyzed for rare codons and gene optimization was performed using optimization software In 2017. The half-life and protein instability index was determined. Secondary and tertiary structure was predicted and evaluated. Linear and conformational epitopes were predicted. Recombinant pET28a/chimeric gene plasmid was transformed to <em>E.coli</em> BL21 DE3 and expression was induced with <a href="https://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwiw_5yb9c7SAhWmK8AKHWvvCTQQFggZMAA&url=https%3A%2F%2Fen.wikipedia.org%2Fwiki%2FIsopropyl_%25CE%25B2-D-1-thiogalactopyranoside&usg=AFQjCNEPF0yCSi5_Xd3NsuViAHXzMipdog&sig2=yt47_inE_4EYAdDJiH8Y8A&bvm=bv.149397726,d.d2s">Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside</a> (IPTG). The protein expression was evaluated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).<br> <strong>Results: </strong>Chimeric protein instability index was 24.04 and the codon adaptation index of chimeric constructs increased to 0.9. The tertiary predicted structure of the chimeric proteins confirmed and mRNA was stable. Conformational and linear epitopes were seen in both domains of the chimeric protein. Restriction analysis confirmed cloning of the gene into pET28a vector. Expression of recombinant protein in <em>E.coli</em> led to the production of chimeric protein with 37 k Da molecular weight.<br> <strong>Conclusions: </strong>According to the results of bioinformatics and recombinant protein expression, the design chimeric protein could be used as an immunogen to evaluate the immunity against cholera.<br> &nbsp;</p> ویبریوکلرا, فاکتورهای ویرولانس, کلرا توکسین, طراحی بیوانفوراتیکی, ژن کایمر Vibrio cholerae, Virulence factors, Cholera toxin, Bioinformatic desigen, Chimeric gene 37 48 http://ijmm.ir/browse.php?a_code=A-10-868-1&slc_lang=fa&sid=1 Milad Amerian میلاد عامریان m.amerianbio@gmail.com 10031947532846009754 10031947532846009754 No Biological Research Center, Faculty and Research Institute for Basic Sciences, Imam Hossein comprehensive University, Tehran, Iran مرکز تحقیقات زیست‌شناسی، دانشکده و پژوهشکده علوم پایه، دانشگاه جامع امام حسین (ع)، تهران، ایران Shahram Nazarian شهرام نظریان nazarian56@gmail.com 10031947532846009755 10031947532846009755 Yes Biological Research Center, Faculty and Research Institute for Basic Sciences, Imam Hossein comprehensive University, Tehran, Iran مرکز تحقیقات زیست‌شناسی، دانشکده و پژوهشکده علوم پایه، دانشگاه جامع امام حسین (ع)، تهران، ایران Hosein Honari حسین هنری honari.hosein@gmail.com 10031947532846009756 10031947532846009756 No Biological Research Center, Faculty and Research Institute for Basic Sciences, Imam Hossein comprehensive University, Tehran, Iran مرکز تحقیقات زیست‌شناسی، دانشکده و پژوهشکده علوم پایه، دانشگاه جامع امام حسین (ع)، تهران، ایران Mohammad Ebrahim Minaie محمد ابراهیم مینایی ebimomi@gmail.com 10031947532846009757 10031947532846009757 No Biological Research Center, Faculty and Research Institute for Basic Sciences, Imam Hossein comprehensive University, Tehran, Iran مرکز تحقیقات زیست‌شناسی، دانشکده و پژوهشکده علوم پایه، دانشگاه جامع امام حسین (ع)، تهران، ایران Emad kordbacheh عماد کردبچه kordkid@gmail.com 10031947532846009758 10031947532846009758 No Biological Research Center, Faculty and Research Institute for Basic Sciences, Imam Hossein comprehensive University, Tehran, Iran مرکز تحقیقات زیست‌شناسی، دانشکده و پژوهشکده علوم پایه، دانشگاه جامع امام حسین (ع)، تهران، ایران