fa طراحی و ساخت پلاسمید حاوی کاست بیانی فیوژن پروتئین CFP-10، ESAT-6 مایکوباکتریوم توبرکولوزیس باکتری شناسی پزشکی Medical Bacteriology مقاله پژوهشی Original Research Article <div align="right" style="direction: rtl"> <b>زمینه و اهداف:</b> در قرن گذشته تنها روش تشخیص عفونت نهفته <i>مایکوباکتریوم توبرکولوزیس</i> آزمایش پوستی توبرکولین بود. این آزمایش در بیماران آلوده با دیگر مایکوباکتریوم ها و در افراد واکسینه با BCG نتایج مثبت کاذب دارد. لذا، لزوم روش های تشخیصی کارآمد، سریع و دقیق مطرح می شود. دو آنتی ژن CFP-10و ESAT-6 در تمام مایکوباکتریوم های پاتوژن وجود دارد ولی در سویه های مولد واکسن BCGو مایکوباکتریوم های فرصت طلب از جمله م<i>ایکوباکتریوم  آویوم</i> وجود ندارد. هدف این مطالعه ساخت سازه بیانی فیوژن پروتئین متشکل از دو ژن اختصاصی رمز کننده CFP-10و ESAT-6 بود. این فیوژن پروتیین در آزمایش اختصاصی تشخیص عفونت فعال و نهفته <i>مایکو باکتریوم توبر کولوزیس</i> به‌کار برده می‌شود. <br> <b>روش بررسی:</b> ‌DNA مایکوباکتریوم توبرکولوزیس(H37Rv )استخراج و تعیین غلظت گردید. برای تکثیر قطعات ESAT-6 ، CFP-10 و قطعه شامل ESAT-6 و CFP-10 پرایمر طراحی گردید و PCR و Overlap PCR انجام شد. محصول PCR حاصل از فیوژن ESAT-6 و CFP-10 در پلاسمید pTZ57T/A کلون شد. سپس پلاسمید pQE-60 وpT-ESAT-CFP با دو آنزیم BamHI و NcoI هضم شد. محصول هضم آنزیمی روی ژل آگارز، الکتروفورز شد. باندهای DNA حاوی ESAT-CFP و pQE-60 خطی شده از ژل آگارز استخراج گردید. قطعه ESAT-CFP در pQE-60 کلون مجدد شد. کلون‌های به‌دست آمده با PCR، هضم آنزیمی وتعیین توالی ارزیابی گردید. پلاسمید نهایی pQ-ESAT-CFP نامیده شد.<br><b> یافته ها:</b> محصولات PCR، پلاسمید pT-ESAT-CFP و پلاسمید نهایی با هضم آنزیمی و تعیین توالی تایید شدند.<br><b> نتیجه گیری :</b> با بیان سازه ژنی pQ-ESAT-CFP و تخلیص فیوژن پروتئین حاصل می‌توان از آن برای ساخت کیت تشخیصی <i>مایکوباکتریوم توبرکولوزیس</i>، جایگزین آزمایش توبرکولین، استفاده کرد. </div> <b>Background and Objectives:</b> <i>Mycobacterium tuberculosis</i>, the causative agent of tuberculosis disease, has infected roughly one third of the world's population. Based on World Health Organization (WHO) reports, around 2 million people die due to this disease annually, necessitating development of an effective, rapid and precise diagnostic strategies to detect tuberculosis. Quantification of interferon-γ which has been secreted by lymphocytes exposed to mycobacterial ESAT-6 and CFP-10 proteins is the basis of a specific diagnostic test to detect latent tuberculosis infection (LTBI). This method is an appropriate replacement for tuberculin skin test (TST) without limitations related to BCG vaccinated individuals. The aim of our study was to create an expression construct which contains genes encoding two specific proteins from M. tuberculosis: ESAT-6 and CFP-10. Expressed fusion protein could be applied to design tuberculosis diagnostic kits.<br><b>Methods and Materials:</b> Genomic DNA from Mycobacterium tuberculosis (H37Rv) was extracted and its concentration was determined. The primers were designed to amplify ESAT-6, CFP-10 and overlap segment of these two genes. PCR1, 2 for ESAT-6 and CFP-10 and finally Overlap PCR were performed. ESAT6-CFP10 fusion segment was cloned in pTZ57T/A cloning vector. PT-ESAT-CFP and PQE-60 plasmids were digested with BamHI and NcoI and ESAT-CFP DNA fragment and back bone of pQE60 were extracted from agarose gel. Then ESAT-CFP was sub-cloned into pQE60.The resulted colonies were analyzed by PCR, restriction endonuclease digestion and sequencing. <br> <b>Results:</b>The results of PCR, restriction enzyme digestion and sequencing for PCR products,pTZ clone and final plasmid, confirmed the authenticity of them.<br><b>Conclusion:</b>The purified fusion protein that resulted from expression of this construct can be used in diagnostic kit for detecting latent tuberculosis infection (LTBI). سل نهفته، فیوژن پروتئینESAT-6CFP-10، کوآنتی فرون Latent tuberculosis, Fusion protein ESAT-6, CFP-10, QuantiFERON 7 13 http://ijmm.ir/browse.php?a_code=A-10-1-10&slc_lang=fa&sid=1 Morasa Farnad مرصع فرناد 100319475328460040 100319475328460040 No Islamic Azad university, Zanjan branche, Zanjan, Iran دانشگاه آزاد اسلامی، واحد زنجان Hossein Khanahmad Shahreza حسین خان احمد شهررضا 100319475328460041 100319475328460041 Yes Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran مجتمع تولیدی تحقیقاتی انستیتو پاستور ایران Bahman Tabaraee بهمن تبرائی 100319475328460042 100319475328460042 No Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran مجتمع تولیدی تحقیقاتی انستیتو پاستور ایران Bahador Yazdan pana بهادر یزدان پناه 100319475328460043 100319475328460043 No Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran مجتمع تولیدی تحقیقاتی انستیتو پاستور ایران Hesam Movassagh حسام موثق 100319475328460044 100319475328460044 No Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran مجتمع تولیدی تحقیقاتی انستیتو پاستور ایران Manochehr Rostami منوچهر رستمی 100319475328460045 100319475328460045 No Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran مجتمع تولیدی تحقیقاتی انستیتو پاستور ایران Tayebeh Sohrabi طیبه سهرابی 100319475328460046 100319475328460046 No Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran مجتمع تولیدی تحقیقاتی انستیتو پاستور ایران Rasoul Mokhah رسول موخواه 100319475328460047 100319475328460047 No Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran مجتمع تولیدی تحقیقاتی انستیتو پاستور ایران Javad Zerehsaz جواد زره ساز 100319475328460048 100319475328460048 No Department of Bacteriology, Medical Sciences College, Tarbiat Modaress university, Tehran, Iran دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده پزشکی، گروه باکتری شناسی Rahim Pirhajati Mahabadi رحیم پیر حاجتی مهابادی 100319475328460049 100319475328460049 No Department of Bacteriology, Medical Sciences College, Tarbiat Modaress university, Tehran, Iran دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده پزشکی، گروه باکتری شناسی