en راه اندازی سریع روش RT-LAMP جهت شناسایی SARS-CoV-2 با راهکار طراحی سازه ژنی میکروب شناسی مولکولی Molecular Microbiology مقاله پژوهشی Original Research Article <p style="font-style: normal; text-align: justify;"><span class="sanspYW"><span style="font-size:14px;"><span style="font-family:IRANsans;"><span style="color:#ffffff;"><strong><span style="background-color:#16a085;">زمینه و اهداف:&nbsp;</span></strong></span>&nbsp;</span></span></span><span style="font-size:14px;"><span style="font-family:IRANsans;"><span style="background:white"><span style="line-height:normal"><span style="vertical-align:baseline"><span style="direction:rtl"><span style="unicode-bidi:embed"><span lang="AR-SA">ویروس سندروم حاد و شدید تنفسی ۲ (</span><span dir="LTR">SARS-CoV-۲</span><span lang="AR-SA">) همچنان یک چالش در نظام سلامت در سراسر جهان است. روش‌های تشخیص مولکولی از جمله روش تکثیر هم‌دما <span style="border:none windowtext 1.0pt; padding:0mm">به واسطه </span>حلقه </span><span lang="FA">با رونوشت‌برداری معکوس</span><span lang="AR-SA"> (</span><span dir="LTR">RT-LAMP</span><span lang="AR-SA">) می‌تواند به قطع زنجیره انتقال ویروس کمک کند. در این مطالعه، راه اندازی سریع این روش با استفاده از رویکرد طراحی سازه ژنی مورد بررسی قرار گرفت.</span></span></span></span></span></span></span></span><br> <span class="sanspYW"><span style="font-size:14px;"><span style="font-family:IRANsans;"><strong><span style="color:#ffffff;"><span style="background-color:#16a085;">مواد و روش کار:&nbsp;</span></span>&nbsp;</strong></span></span></span><span style="font-size:14px;"><span style="font-family:IRANsans;"><span style="background:white"><span style="line-height:normal"><span style="vertical-align:baseline"><span style="direction:rtl"><span style="unicode-bidi:embed"><span lang="AR-SA">در ابتدا روش </span><span dir="LTR">RT-LAMP</span><span lang="AR-SA"> با استفاده از سازه های ژنی بعنوان کنترل مثبت راه اندازی و بهینه سازی شد و بطور همزمان برای آزمون های</span>&nbsp;<span dir="LTR">RT-LAMP</span><span lang="AR-SA"> و </span><span dir="LTR">RT-PCR</span><span lang="AR-SA"> استفاده شد. ژن سنتزی مشتمل بر توالی پروموتر </span><span dir="LTR">T۷</span><span lang="AR-SA"> و بخشی از توالی ژن‌های </span><span dir="LTR">E</span> <span lang="AR-SA">، </span><span dir="LTR">RdRp</span><span lang="AR-SA">، </span><span dir="LTR">N</span>&nbsp;<span lang="AR-SA"> بروش مصنوعی سنتز ژن و سابکلونینگ در ناحیه کلونینگ پلاسمید </span><span dir="LTR">pUC۵۷</span><span lang="AR-SA"> انجام شد و در سنتز مصنوعی </span><span dir="LTR">RNA</span><span lang="AR-SA"> بکار رفت. در نهایت شرایط واکنش</span>&nbsp;<span dir="LTR">RT-LAMP</span><span lang="AR-SA"> بهینه و بر روی </span><span dir="LTR">RNA</span><span lang="AR-SA"> بالینی بررسی شد.</span></span></span></span></span></span></span></span><br> <span class="sanspYW"><span style="font-size:14px;"><span style="font-family:IRANsans;"><span style="color:#ffffff;"><strong><span style="background-color:#16a085;">یافته ها:&nbsp;</span></strong></span>&nbsp;</span></span></span><span style="font-size:14px;"><span style="font-family:IRANsans;"><span style="background:white"><span style="line-height:normal"><span style="vertical-align:baseline"><span style="direction:rtl"><span style="unicode-bidi:embed"><span lang="AR-SA">در ابتدا آزمون </span><span dir="LTR">RT-LAMP</span><span lang="AR-SA"> با موفقیت برای تشخیص ویروس کرونا با استفاده از نسخه‌های </span><span dir="LTR">RNA</span><span lang="AR-SA"> سنتزی راه اندازی شد. بدنبال آن آزمون به ترتیب بر روی نمونه‌های بالینی با زمان واکنش ۳۵ و ۴۰ دقیقه برای واکنش شماره ۱ و ۲ از </span><span dir="LTR">RT-LAMP</span><span lang="AR-SA"> انجام شد. حد تشخیص ۱۰۰ نسخه ژن هدف در هر واکنش برای این آزمون ها تعیین گردید</span><span dir="LTR" style="border: 1pt none windowtext; padding: 0mm;">.</span></span></span></span></span></span></span></span><br> <span class="sanspYW"><span style="font-size:14px;"><span style="font-family:IRANsans;"><strong><span style="color:#ffffff;"><span style="background-color:#16a085;">نتیجه‌گیری:&nbsp;</span></span>&nbsp;</strong></span></span></span><span style="font-size:14px;"><span style="font-family:IRANsans;"><span style="background:white"><span style="line-height:normal"><span style="vertical-align:baseline"><span style="direction:rtl"><span style="unicode-bidi:embed"><span lang="AR-SA">در این تحقیق، راه اندازی سریع روش</span>&nbsp;<span dir="LTR">RT-LAMP</span><span lang="AR-SA"> ابتدا بر روی سازه ژنی مشتمل بر ژن‌های کروناویروس صورت گرفت و اعتبارسنجی بطور همزمان به روش</span>&nbsp;<span dir="LTR">RT-PCR</span><span lang="AR-SA"> انجام شد. این راهکار انعطاف‌پذیر می‌تواند بعنوان یک راه حل کارآمد در جایی که نمونه بالینی </span><span lang="FA">ابتدائا </span><span lang="AR-SA">در دسترس نیست با ورود ژن هدف مدنظر در ناحیه الحاقی سازه ژنی بکار رود.</span></span></span></span></span></span></span></span></p> <p style="text-align: justify;"><span style="font-family:Times New Roman;"><span style="font-size:16px;"><span style="color:#ffffff;"><strong><span style="background-color:#16a085;">Background and Aim:</span></strong></span>&nbsp;</span></span><span style="font-size:16px;"><span style="font-family:Times New Roman;"><span style="line-height:107%">The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is still an ongoing challenge in health system worldwide. Molecular detection methods including reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) can help cutting off the transmission chain of the virus. In this study, prompt setting up of the RT-LAMP assays were investigated using gene construct design approach.</span></span></span><br> <span style="font-family:Times New Roman;"><span style="font-size:16px;"><strong><span style="color:#ffffff;"><span style="background-color:#16a085;">Materials and Methods:</span></span></strong>&nbsp;</span></span><span style="font-size:16px;"><span style="font-family:Times New Roman;">RT-LAMP assays were initially setup and optimized using gene constructs as positive controls which worked simultaneously for RT-LAMP and RT-PCR assays. Constructed genes included T7 promoter sequence and partial sequences of SARS-CoV-2 RdRp, N and E genes cloned into pUC57 multiple cloning site (MCS) via synthetic and subcloning procedures. These templates were then used for artificial RNA synthesis. Finally, the RT-LAMP assay parameters were optimized and applied to clinical RNA specimens.</span></span><br> <span style="font-family:Times New Roman;"><span style="font-size:16px;"><strong><span style="color:#ffffff;"><span style="background-color:#16a085;">Results:</span></span></strong> </span></span><span style="font-size:16px;"><span style="font-family:Times New Roman;">As an initial rapid approach, RT-LAMP assays were successfully setup for SARS-CoV-2 diagnostic using <i>in vitro</i> RNA transcripts from gene constructs. The assays were then examined on clinical samples with reaction times of 35 and 40 min required for assay one and two respectively. The detection limit was 100 copies of the target gene per reaction for each assay.</span></span><br> <span style="font-family:Times New Roman;"><span style="font-size:16px;"><strong><span style="color:#ffffff;"><span style="background-color:#16a085;">Conclusion:</span></span></strong>&nbsp;</span></span><span style="font-size:16px;"><span style="font-family:Times New Roman;">Here, prompt setting up of RT-LAMP assays was carried out initially on designed gene constructs containing different SARS-CoV-2 target genes and simultaneous validation by RT-PCR. This approach could be used as an efficient solution where the clinical specimens may not initially be available, with the feasibility for new target gene of interest to be inserted into the MCS position.</span></span></p> <p style="text-align: justify;"><p style="text-align: justify;"></p></p> <p style="text-align: justify;"><div></div></p> ویروس سندروم حاد و شدید تنفسی 2, بیماری عالم‌گیر کووید-19, روش تکثیر هم‌دما به واسطه حلقه با رونوشت‌برداری معکوس, روش‌های تشخیصی مولکولی SARS-CoV-2, COVID-19 Pandemic, Molecular Diagnostic Techniques, RT-LAMP Assay 329 338 http://ijmm.ir/browse.php?a_code=A-10-146-1&slc_lang=en&sid=1 Mohsen Vaez محسن واعظ vaez_m@yahoo.com 100319475328460025580 0000000151925482 Yes Department of Biotechnology, Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Tehran, Iran پژوهشکده زیست فناوری، سازمان پژوهش های علمی و صنعتی ایران، تهران، ایران Nazanin Kazemimejad نازنین کاظمی نژاد nazanin.kazeminejad@gmail.com 100319475328460025581 0009-0002-2130-3222 No Department of Biotechnology, Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Tehran, Iran پژوهشکده زیست فناوری، سازمان پژوهش های علمی و صنعتی ایران، تهران، ایران Jalil Fallah Mehrabadi جلیل فلاح مهرآبادی jalil.fallah@gmail.com 100319475328460025582 0000000175796208 No The Lister Laboratory of Microbiology, Tehran, Iran آزمایشگاه میکروب شناسی لیستر، تهران، ایران