fa تشخیص سریع اسپور عامل سیاه زخم به روش مولکولی باکتری شناسی پزشکی Medical Bacteriology مقاله پژوهشی Original Research Article <div align="right" style="direction: rtl"> <b>زمینه و اهداف:</b> باسیلوس آنتراسیس باکتری اسپور دار، گرم مثبت، هوازی و عامل بیماری سیاه زخم است. در سال های اخیر از این باکتری در حملات بیوتروریستی استفاده شده است. اسپور باسیلوس آنتراسیس نسبت به عوامل فیزیکی و شیمیایی بسیار مقاوم می باشد. برای تشخیص سریع اسپور این باکتری به روش های مولکولی، به اسنخراج ژنوم با شکستن اسپور نیاز می باشد. هدف از این مطالعه تشخیص سریع مولکولی D‏NA باسیلوس آنتراسیس به روشMultiplex PCR با شکستن سریع اسپور به روش فیزیکی در زمان بسیار کوتاه و بدون استخراج ژنوم است. <br><b>روش بررسی:</b> اسپورباکتری غیر بیماریزای سیاه زخم یا سویه استرن (سویه واکسن باسیلوس آنتراسیس) توسط سیستم (BioSpec Products, In.) Mini Bead Beater-8 با استفاده از بید های 0.1 میلی متری در 5000 دور در دقیقه شکسته و استخراج شد. تشخیص به روش PCR Multiplex با استفاده از 3 جفت پرایمر صورت گرفت. PCR سه قطعه DNA با اندازه های مورد انتظار را تولید نمود که در ژل آگاروز الکتروفورز آنالیز شد. جهت تعیین حد تشخیص و اختصاصیت از رقت های مختلف اسپور به روش CFU/ml و باکتری های دیگر همین جنس نیز استفاده گردید. <br><b>یافته ها:</b> اسپورهای باســیلوس آنتراسـیس در عرض سـه دقیـقه شکـست شـد. با استـفاده از پرایـمرهای اختـصاصی و Multiplex PCR، محصولات به دست آمده شامل سه قطعه (1083bp، 385bp، 164bp) در ژل آگارز 2 درصد آنالیز شد. با استفاده از آنزیم برش دهنده Hind IIIمحصول (1083bp) تایید گردید. حد تشخیص بر اساس روش CFU/ml، رقت 1.512 از سوسپانسیون با 7680/ml یا 7 اسپور در میلی لیتر اسپور معین شد. <br><b>نتیجه گیری: </b>نـتایج بهـینه سـازی نشـان داد شـکستن به روش فیـزیـکی با اسـتفاده از ذرات شیـشه و دستـگاه Bead Mill Homogenization از سرعت لازم برخوردار می باشد. بعد از شکست در مدت 3 دقیقه، نیازی به استخراجDNA نیست. با این روش، ما توانستیم به طور سریع، اختصاصی و با حساسیت بالا اسپور باکتری باسیلوس آنتراسیس را در نمونه ها تشخیص دهیم.  </div> <b>Background and Objectives:</b> Bacillus anthracis as a spore-forming, aerobic, gram-positive bacterium is the causative agent of the anthrax disease. Inrecent years, it has been used in the bioterrorism attacks. Its spore is highly resistant to physical and chemical agents. For rapid detection of B.anthracis spore by molecular methods, it is necessary to extract genomic DNA by disrupting the spores. The aim of this study was rapid molecular detection of B.anthracis DNA by Multiplex PCR using rapid physical disruption of spore in a short time without extraction of the genome. <br><b>Material and Method: </b>Genome of non-virulent strain of B.anthracis spores (Stern Vaccine strain) was extracted by Mini Bead Beater-8 system by using 0.1 mm glass beads in 5000 RPM. The sample was directly used for PCR. Multiplex PCR technique was used for detection of bacterial DNA using 3 pairs of primers. Amplified PCR products generated 3 fragments of DNA that were analyzed by agarose gel electrophoresis. Detection limit and specificity of the test were determined at different spore dilutions by using other bacterial strains belonging to the same genus. <br><b>Results:</b> By this method, B.anthracis spores could be disrupted within 3 minutes, and detected with specific primers by Multiplex PCR method. PCR products of 1083bp, 385bp, 164bp were analyzed in %2 agarose gel. By Hind III restriction enzyme, larger PCR product (1083bp) was confirmed. Detection limit by CFU/ml method was determined by 1/512 dilution of suspension with 7680/ml spore or 7 spore/µl. <br><b>Conclusions:</b> The results of optimization showed that the physical disruption method by glass bead and Bead Meal Homogenization has the proper speed of 3 minutes and there is no need for DNA extraction. By this method, we were able to rapidly disrupt, detect the spore of B.anthracisin samples specifically and with high sensitivity. تشخیص، باسیلوس آنتراسیس، اسپور، Multiplex PCR Rapid detection- Bacillus anthracis- Spore - Multiplex PCR 10 17 http://ijmm.ir/browse.php?a_code=A-10-1-112&slc_lang=fa&sid=1 Shahram Parvin شهرام پروین 1003194753284600619 1003194753284600619 No Molecular Biology Research Center, Baqiyatallah University of Medical Science, Tehran, Iran مرکز تحقیقات بیولوژی مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه اله (عج) Fatemeh Ahmadi فاطمه پورعلی 1003194753284600620 1003194753284600620 No Molecular Biology Research Center, Baqiyatallah University of Medical Science, Tehran, Iran مرکز تحقیقات بیولوژی مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه اله (عج) Ali Poorali علی کرمی 1003194753284600621 1003194753284600621 No Molecular Biology Research Center, Baqiyatallah University of Medical Science, Tehran, Iran مرکز تحقیقات بیولوژی مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه اله (عج) Ali Karami علی احمدی Karami@bmsu.ac.ir 1003194753284600622 1003194753284600622 Yes Molecular Biology Research Center, Baqiyatallah University of Medical Science, Tehran, Iran مرکز تحقیقات بیولوژی مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه اله (عج)