جمعآوری نمونه
در مجموع تعداد 35 نمونه از منابع آبی بیمارستانهای آموزشی دانشگاه علوم پزشکی ایران مانند شیر آب و سایر تجهیزات پزشکی مانند مانومتر، دستگاه دیالیز، نبولایزر، ونتیلاتور و یونیتهای دندانپزشکی در طی سالهای 1394 الی 1397جمعآوری شد. تقریبا 50 میلیلیتر از هر نمونه آب جمعآوری شد و برای آزمایش سریعا به آزمایشگاه انتقال داده شد.
آمادهسازی نمونه و کشت
نمونههای آب در دور 3000 rpm به مدت 30 دقیقه سانتریفوژ شد. رسوب (3 میلیلیتر) حاصله از سانتریفوژ به دو لوله استریل انتقال داده شد و هر کدام توسط روش جداگانهای آلودگیزدایی شد. در روش اول، پس از سانتریفیوژ به میزان 5/1 میلیلیتر سود 1% و 1/5 میلیلیتر SDS 3% جهت الودگی زدایی اضافه و سپس به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق همراه با تکان دادن انکوبه شد. در مرحله بعد با اضافه کردن معرف فنل فتالئین و اسید فسفوریک 40% خنثیسازی صورت گرفت. سپس نمونهها به مدت30 دقیقه با دور 3000rpm سانتریفیوژ شدند. مایع رویی دور ریخته و سپس رسوب باقی مانده در دو لولۀ مجزا حاوی محیط کشت لوون اشتاین جانسون (LJ) کشت داده شد و هر کدام در دمای 37 و 25 درجه سلسیوس قرار داده شد. روش دوم به این صورت بود که پس از سانتریفیوژ، به اندازۀ هم حجم نمونه محلول CPC 0/05% (cetylpyridiniumchloride) اضافه شد، نمونهها به مدت 20 دقیقه در دمای محیط همراه با تکان دادن انکوبه شد و سپس با دور 3000rpm به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. پس از دور ریختن مایع رویی، به رسوب حاصله 2 میلیلیتر آب مقطر استریل جهت خنثیسازی باقی مانده CPC اضافه شد. سپس با دور 3000rpm به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد و در نهایت رسوب باقیمانده در دو لولۀ مجزا حاوی محیط کشت LJ کشت داده شد و در دو دمای 37 و 25 درجه سلسیوس قرار داده شد. محیطهای کشت یک روز در میان به مدت 5 ماه برای مشاهده پیدایش احتمالی کلنی بررسی شدند. پس از ظاهر شدن کلنی، رنگآمیزی اسید فست به روش زیل-نلسون انجام شد و در نهایت هویت کلنیهای جداشده با تستهای فنوتیپیک (شکل کلنی، سرعت رشد و تولید پیگمان) و با روش ملکولی تایید نهایی شدند (14).
در جداسازی اولیه به دلیل آلودگی فراوان نمونهها با مخمر و قارچ ،غلظتهای مختلف سیکلوهگزامید به محیط کشت LJ اضافه شد تا از رشد آنها جلوگیری شود. به همین منظور غلظتهای مختلف سیکلوهگزامید به ازای هر 1600 سی سی محیط کشت LJ به ترتیب شامل: 0/025، 0/05، 0/06، 0/64 ، 0/2 ، 0/3 ، 0/5 ، 1 گرم به محیط کشت اضافه شد. بهترین غلظت سیکلوهگزیمید جهت جداسازی مایکوباکتریومها 1- 0/3 گرم بود. همچنین جهت جداسازی کامل کلنی محیطهایی که ترکیبی از آلودگی باکتریایی و قارچی داشتند از چهار روش تیمار زیر استفاده شد. در روش اول، کلنیهای آلوده با قارچها از سطح محیط کشت برداشته شد و در 200 میکرولیتر آب مقطر استریل در یک فالکون استریل حل شد، سپس هم حجم نمونه، CPC اضافه شد و ورتکس صورت گرفت. حدود نیم ساعت در دمای محیط همراه با تکان دادن انکوبه شد. سپس در دور 3000rpm به مدت 30 دقیقه سانتریفیوژ شد. در مرحله بعد مایع رویی را دور ریخته و پس از آن برای شست و شو، 200 میکرولیتر آب مقطر استریل به نمونه اضافه و دوباره به مدت 15 دقیقه با دور 3000rpm سانتریفیوژ شد. مایع رویی دور ریخته شده و در نهایت رسوب باقی مانده کشت داده شد. در روش دوم، کلنیهای آلوده با قارچها از محیط کشت برداشته و در 200 میکرولیتر آب مقطر استریل در یک فالکون استریل حل شد. سپس به میزان 1/5 میلیلیتر سود 1% و 1/5 میلیلیتر SDS 3% به آن اضافه و ورتکس صورت گرفت و به مدت 30 دقیقه در دمای محیط همراه با تکان دادن انکوبه شد. در مرحله بعد با اضافه کردن معرف فنل فتالئین و اسید فسفوریک 40% خنثیسازی صورت گرفت. سپس نمونهها به مدت30 دقیقه با دور 3000rpm سانتریفیوژ شد. مایع رویی را دور ریخته و در نهایت رسوب باقی مانده کشت داده شد. در روش سوم، کلنیهای آلوده از محیط کشت برداشته و در 200 میکرولیتر آب مقطر استریل در یک فالکون استریل حل شد. سپس به میزان 200 میکرولیتر اگزالیک اسید 5% به محلول اضافه و ورتکس صورت گرفت. سپس به مدت 30 دقیقه در دمای محیط همراه با تکان دادن انکوبه شد. پس از آن، نمونه به مدت30 دقیقه با دور 3000rpm سانتریفیوژ شد. مایع رویی را دور ریخته و در نهایت رسوب باقی مانده کشت داده شد. در روش آخر، کلنیهای آلوده از محیط کشت برداشته و در 200 میکرولیتر آب مقطر استریل در یک فالکون استریل حل شد. سپس به میزان 5/1 میلیلیتر سود 1% و 5/1 میلیلیتر SDS 3% به آن اضافه شد و ورتکس صورت گرفت. در مرحلۀ بعد، به مدت 30 دقیقه در دمای محیط همراه با تکان دادن انکوبه شد. سپس با اضافه کردن معرف فنل فتالئین و اسید فسفوریک 40% خنثیسازی صورت گرفت. نمونهها به مدت30 دقیقه با دور 3000rpm سانتریفیوژ شد. مایع رویی دور ریخته شد و رسوب به دست آمده ورتکس شد و سپس مجددا به رسوب حاصل 200 میکرولیتر اگزالیک اسید 5 درصد اضافه شد،40 دقیقه در دمای محیط همراه با تکان دادن انکوبه شد و در نهایت نمونه به مدت30 دقیقه با دور 3000rpm سانتریفیوژ شد. مایع رویی دور ریخته و رسوب باقی مانده کشت داده شد. در نهایت جهت خالصسازی نهایی و تیمار نمونههای آلوده از روش چهارم استفاده شد و سپس بر روی محیط کشت LJ حاوی سیکلوهگزامید کشت داده شد.
جهت جداسازی بهتر، از محیط کشتهای زیر نیز جهت کشت مجدد مورد استفاده قرار گرفت. این محیط کشتها شامل محیط کشت انفیوژن قلبی مغزی (BHI) آگار، محیط کشت مکانکی آگار، محیط کشت بلاد آگار حاوی نالیدیکسیک اسید، محیط کشت بلاد آگار حاوی پنی سیلین، محیط کشت بلاد آگار حاوی نالیدیکسیک اسید و پنی سیلین و محیط کشت LJ حاوی نالیدیکسیک اسید ، پنی سیلین و سیکلوهگزامید بودند.
از میان روشهای استفاده شده، مایکوباکتریومهای غیر سلی با دو روش نشان داده شده در جدول 1 جداسازی شدند. غلظتهای 0/025، 0/05، 0/06 گرم تا حدودی از رشد قارچها و مخمرها جلوگیری کردند، اما نتوانستند بهطور کامل از رشد آنها جلوگیری کنند. غلظتهای 0/64 تا 0/2 گرم بیش از نیمی از آلودگیهای قارچی و مخمری را متوقف کردند، درحالیکه در غلظتهای 0/3 و 0/5 گرم هیچگونه آلودگی قارچی یا مخمری مشاهده نشد. البته در برخی مواقع تعداد کمی از کلنی قارچ و مخمر دیده میشد که در غلظت 1 گرم از سیکلوهگزیمید، این آلودگیها هم از بین رفت.
تیمار کلنیهای مایکوباکتریایی آلوده با قارچها یا باکتریهای دیگر با CPC 0/05 تا 1% ، سود 1-2% و SDS 3% آلودگیهای مدنظر را از بین نبرد. تیمار کردن با اسید اگزالیک 3-5% آلودگی را کاهش داد ولی بهطور کامل آن را از بین نبرد. بدین صورت که پس از چند روز، سطح آلودگی با مخمرها و سایر باکتریها افزایش یافت. در نهایت، سود 1-4 %، SDS 3% و اسید اگزالیک 5% بهطور کامل آلودگی را از تمام محیط کشت از بین برد و مایکوباکتریومها بهطور خالص رشد کردند.
بر روی محیط BHI پس از چندین ماه انکوباسیون، هیچ رشدی از مایکوباکتریومها مشاهده نشد. بر روی محیطهای کشت مک کانکی آگار و بلاد آگار حاوی پنی سیلین و اسید نالیدیکسیک، پس از چند روز انکوباسیون، باکتریهای گرم منفی بر روی همه محیطهای کشت مشاهده شد و هیچگونه رشد مایکوباکتریومها مشاهده نشد. بر روی محیط کشت LJ حاوی آنتی بیوتیک، آلودگی مشاهده نشد و پس از یک الی دو ماه، رشد کمی از مایکوباکتریومها مشاهده شد که نسبت به محیط کشت LJ حاوی سیکلوهگزیمید بدون آنتیبیوتیک رشد کمتری از مایکوباکتریومها مشاهده شد.
جدول 1. نتایج حاصل از رشد جدایههای مایکوباکتریایی از منابع آبی بیمارستان با استفاده از روشهای تیمار مختلف
روش تیمار |
دما |
مثبت |
منفی |
آلودگی |
سود 1%+ SDS3% |
37 درجه سلسیوس |
19 |
9 |
7 |
25 درجه سلسیوس |
24 |
7 |
4 |
|
CPC 05/0 |
37 درجه سلسیوس |
0 |
33 |
2 |
25 درجه سلسیوس |
26 |
1 |
1 |
در بسیاری از مطالعاتی که در ایران صورت گرفت، همانند مطالعه ما از روش NaOH 1% و SDS 3% استفاده شده، اما به نظر میرسد استفاده از غلظتهای پایین CPC نیز اثر خوبی در جداسازی مایکوباکتریومهای غیرسلی داشته باشد که البته بسته به حجم نمونۀ مورد استفاده نتایج ممکن است متفاوت باشد. بر خلاف سایر مطالعات انجام شده که از حجم نمونۀ یک لیتری استفاده کردند، در این مطالعه از حجم آب کمتری (50 میلیلیتر ) استفاده شد. در نهایت استفاده از روش تیمار با استفاده از NaOH 1%، اسید اگزالیک 5% و SDS 3% همراه با کشت بر روی محیط کشتLJ حاوی 3/0گرم سیکلوهگزامید بهعنوان یک روش مناسب برای جداسازی مایکوباکتریومهای محیطی توصیه میشود.
این مطالعه توسط معاونت تحقیقات و فناوری دانشگاه علوم پزشکی ایران با شماره طرح 30-01-95-27867 حمایت مالی شده است.
بین نویسندگان تعارض منافع گزارش نشده است.
بازنشر اطلاعات | |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |