سال 13، شماره 3 - ( مرداد - شهریور 1398 )                   جلد 13 شماره 3 صفحات 193-180 | برگشت به فهرست نسخه ها


XML English Abstract Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Faraji Kafshgari S, Maghsoodlou Y, Khomeiri M, kashiry M, Babaei A. Isolation of Escherichia coli specific Lytic Phages from Waste Water and evaluation of its antimicrobial effect In Vitro and Chicken meat. Iran J Med Microbiol 2019; 13 (3) :180-193
URL: http://ijmm.ir/article-1-951-fa.html
فرجی کفشگری سمانه، مقصودلو یحیی، خمیری مرتضی، کشیری محبوبه، بابایی آرش. جداسازی فاژ لیتیک اختصاصی اشریشیاکلی از فاضلاب و بررسی اثر ضدمیکروبی آن در گوشت مرغ. مجله میکروب شناسی پزشکی ایران. 1398; 13 (3) :180-193

URL: http://ijmm.ir/article-1-951-fa.html


1- گروه علوم و مهندسی صنایع غذایی، دانشکده صنایع غذایی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی، گرگان، ایران
2- گروه علوم و مهندسی صنایع غذایی، دانشکده صنایع غذایی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی، گرگان، ایران ، y.maghsoodlou@au.ac.ir
3- گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه ملایر، ملایر، ایران
متن کامل [PDF 1625 kb]   (2252 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (4527 مشاهده)
متن کامل:   (5554 مشاهده)

مقدمه


جنس امروزه با وجود پیشرفت­هایی که در صنعت پرورش طیور گوشتی و به‌ویژه مرغ انجام شده است، باز هم بیماری­های منتقل‌شونده از طریق مصرف گوشت آلوده طیور، گریبان­گیر بسیاری از اقشار جامعه شده است (1). دلیل اصلی بروز این بیماری­ها، احتمالاً عدم انجام کنترل و بازرسی مؤثر در کشتارگاه­های طیور و همچنین عدم رعایت بهداشت در مراکز عمل‌آوری و پخش مرغ است. بنابراین مشخص شدن جنبه­های اپیدمیولوژیکی آلودگی گوشت مرغ که سرشار از منابعی مانند فسفر، آهن، پروتئین و ویتامین D بوده و یکی از پرمصرف­ترین اقلام غذایی ایرانیان محسوب می­شود، بسیار پراهمیت است (2). باکتری اشریشیاکلی یکی از مهم­ترین آلوده‌کننده­های موجود در گوشت مرغ محسوب­ می­شود (3). اشریشیاکلی، پاتوژنی فرصت­طلب است که در روده بزرگ انسان و سایر حیوانات وجود دارد. وجود این باکتری در آب و مواد غذایی دلیل بر آلودگی آن­ها از طریق منابع مدفوعی است. عفونت ادراری، سپتی­سمی، مننژیت نوزادی و اسهال مسافران شایع­ترین عوارض بیماری ناشی از این باکتری هستند (4). این باکتری همچنین، عامل اصلی اسهال مسافران است؛ این بیماری در نقاطی که بهداشت فردی رعایت نمی­شود شایع است. برخی مواد غذاییِ در معرض خطرِ این باکتری عبارتند از گوشت، فرآورده­های دامی، آب آلوده و سبزی­های خام و سالاد. این باکتری­های بیماری­زا موجب آلودگی  در زنجیره مواد غذایی می­شوند. بنابراین، عدم شناسایی آن­ها می­تواند اثرات بدی به ­بار آورد. بنابراین نیاز به توسعه روش­های جدید برای تشخیص و کنترل این عوامل که سریع و قابل اعتماد باشند، لازم است (5).
باکتریوفاژهــا دســته­ ای از ویروس ­هـایی هسـتند کـه فقـط بـاکتری­ها را آلـوده می­کنند. این ویروس ­ها از منابع متعددی مانند خـاک، آب­هــای شــیرین، آب دریــا، فاضــلاب­ها و... قابــل جداســازی هســتند (6). فاژها عوامل ضدمیکروبی طبیعی در صنایع غذایی و بالینی هستند. امروزه ایمنی مواد غذایی توسط فاژها علیه باکتری­های بیماری­زای غذازاد بهبود یافته است (8 ،7). فاژها سلول­های باکتریایی میزبان خود را از طریق جذب و سپس شناسایی مولکولی سطح سلول باکتری، آلوده می­کنند و به سطح پلی­ساکاریدی یا پروتئینی باکتری متصل می­شوند (9).
باکتریوفاژهـا بـه­طور بـالقوه برای جایگزین شدن بـه­جای نگه­دارنده­های شیمیایی، دارای چندین مزیت ساختاری و ژنتیکـی بسـیار مطلـوب هستند. یکی از این مزایا این است که فاژها انگل­های اجباری درون‌سلولی باکتری­ها هستند و عملکرد اختصاصی دارند؛ همچنین عــدم توانــایی آلــوده کــردن ســلول­های یوکــاریوتی و تــأثیر مســتقیم بــر سلول­های هدف نیز از مزایای مهم کاربرد فاژها است (10). باوجود مزایای ذکر شده، چالش­هایی همچون مقاومت فاژی، اثرات جانبی، فاژ کانورژن مثبت و منفی، امکان جهش فاژ ویرولانت و تبدیل شدن به فاژ معتدل (لیزوژنیک) در استفاده از فاژها به­عنوان عوامل طبیعی ضدمیکروبی وجود دارد (11).
 ویژگی طبیعی فاژها در حذف باکتری­ها، آن­ها را به­عنوان عوامل جایگزین مناسب برای آنتی­بیوتیک­ها و نگه­دارنده­های شیمیایی به­عنوان ابزار کنترل باکتری­های بیماری­زا در صنایع غذایی معرفی کرده است (12). با این وجود، تصورات عمومی غلط مربوط به ایمنی فاژها، استفاده از آن­ها در مواد غذایی را به یک مسئله در کاربرد تجاری تبدیل کرده است و همواره سوالات زیادی دربارۀ مناسب بودن فاژها برای تیمار مواد غذایی وجود دارد. البته فاژها با وجود اینکه همه­جا حضور دارند اما توانایی ایجاد عفونت در سلول­های حیوانی را ندارند و می­توان از آن­ها در ایمنی مواد غذایی استفاده کرد (13).
هدف از این مطالعه، جداسازی فاژ لیتیک اختصاصی اشریشیاکلی، شناسایی خانواده احتمالی آن از طریق مورفولوژی فاژ، و همچنین ارزیابی کارایی آن جهت کاهش باکتری اشریشیاکلی در شرایط آزمایشگاهی و گوشت مرغ است.

مواد و روش‌ها

از باکتری اشریشیاکلی (1330: PTCC) به­عنوان باکتری میزبان (هدف) جهت جداسازی و تکثیر فاژ از سازمان پژوهش­های علمی و صنعتی ایران تهیه شد. 5 سویه دیگر از باکتری­های اشریشیاکلی با ATCC (25922، 35218، 33876) از انستیتو پاستور ایران و همچنین اشریشیاکلی 5DHα (2197:SCC) و 21BL  (5976:PTA ) و باکتری­های استافیلوکوکوس اورئوس (2392: ATCCیرسینیا انترکولیتیکا (1785:PTCC ) و  سالمونلا انتریکا (14028ATCC ) نیز از کشت میکروبی دانشگاه ملایر تهیه شدند. محیط کشت­­های نوترینت براث (Nutrient Broth- NB) برای فعال­سازی باکتری لیوفلیزه و لوریا برتانی (LB-Luria Bertani)- (مرک آلمان)- جهت رشد باکتری­ میزبان، تکثیر فاژ و شمارش سلول­های باکتریایی اشریشیاکلی پس از انجام آزمون­های ضدمیکروبی استفاده شدند.
آماده­سازی باکتری
آمپول لیوفیلیزه باکتری­ اشریشیاکلی در شرایط استریل و در زیر هود لامینار (مدل AX-120-2THC- ساخت ایران) شکسته شد. سپس با استفاده از سمپلر، حدود 5/0 میلی­لیتر از محیط کشت NB استریل به آن اضافه شد تا سوسپانسیون باکتری حاصل شود. سپس سوسپانسیون باکتری به محیط کشت جامد­ LB منتقل و به­مدت 24 ساعت در گرم­خانه (032XB - ساخت فرانسه) با دمای 37 درجه سلسیوس گرم‌خانه‌گذاری شد (14).
جداسازی فاژ
نمونۀ فاضلاب از پساب کارخانۀ لبنی شهر ملایر جمع­آوری و در بطری­های درب­دار استریل به آزمایشگاه منتقل و در دمای 4 درجه سلسیوس نگه­داری شد. پس از نمونه­برداری، به­منظور غنی­سازی تعداد فاژهای احتمالی موجود در فاضلاب، 100 میلی­لیتر از نمونه فاضلاب با 50 میلی­لیتر از محیط کشت مایع LB در یک ارلن استریل مخلوط و باکتری­های میزبان مورد نظر به داخل آن تلقیح شدند. سپس ارلن در گرم­خانه شیکردار ( مدل ISCWS94 - ساخت ایران) در دمای 37 درجه سلسیوس و چرخش 100 دور در دقیقه به­مدت 24 ساعت گرم­خانه­گذاری شد. برای جداسازی فاژ، 50 میلی­لیتر از مخلوط داخل ارلن به­مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ (مدل 220 TL ساخت آلمان) گردید. سپس، مایع رویی را مستقیماً در سرنگ 10 میلی­لیتری ریخته و سوسپانسیون حاصل را با فیلتر 45/0 نانومتر داخل یک لوله فالکون تازه، فیلتر شد. روی این سوسپانسیون رقت سریالی تهیه گردید. از هرکدام از رقت­های شماره 6 ،7 و 8 به­مقدار 100 میکرولیتر برداشته شده و با 5/2 میلی­لیتر محیط LB آگار ذوب شده (حدود 50 درجه سلسیوس) و 200 میکرولیتر باکتری اولیه در بن ماری مخلوط کرده و روی پلیت LB آگار ریخته و با چرخاندن پخش شد. سپس به­مدت 24 ساعت در 37 درجه سلسیوس گرم­خانه­گذاری گردید (15).
خالص­سازی و ذخیره­سازی فاژ
در اغلب موارد با توجه به استفاده از مخزن فاضلاب برای جداسازی، امکان حضور بیش از یک نوع فاژ در پلیت جداسازی وجود دارد؛ این فاژها پلاک­هایی با اشکال و اندازه­های مختلف ایجاد می­کنند. پلاک­های لیتیک با شکل و اندازه­های تقریباً یکسان با سر سمپلر استریل برداشته­ شده و در 500 میکرولیتر محیط LB داخل میکروتیوب 5/1 میلی­لیتری ریخته شد. این میکروتیوب به­مدت 15 دقیقه در دمای اتاق باقی ماند. سپس رقت سریالی تهیه شد. به­خاطر اطمینان از حضور یک نوع فاژ یا چند نوع فاژ، این پلاک­ها به­طور جداگانه خالص­سازی شدند. از هر میکروتیوب 100 میکرولیتر برداشته شده، با 200 میکرولیتر باکتری اولیه و 5/2 میلی­لیتر محیط LB آگار مخلوط گردید، در پلیت LB آگار ریخته شد و به­مدت 24 ساعت در 37 درجه سلسیوس گرم­خانه­گذاری گردید تا پلاک­های ایجاد شده مشاهده شدند. به­منظور ذخیره­سازی فاژهای جداسازی شده از استوک فاژ که در براث بود، 500 میکرولیتر برداشته شد و با 500 میکرولیتر گلیسرول استریل در میکروتیوب مخلوط گردید و تکان داده شد تا دو فاز ایجاد نشود. ذخیره­سازی فاژ­ها در 70- درجه انجام شد (15).
 
شناسایی موروفولوژی و تشخیص خانواده فاژ به­کمک میکروسکوپ الکترونی گذاره (Transmission Electron Microscopy-TEM)
به­منظور بررسی مورفولوژیک فاژهای جداسازی شده، تصویربرداری با TEM (Zeiss-EM10C-100 KV- آلمان) انجام شد. برای مشاهده ساختمان فاژ، نمونه­های فاژ غلیظ شده در مرحله قبل، به­صورت رنگ­آمیزی منفی رنگ­آمیزی شدند. بدین منظور، ابتدا یک قطره از نمونه روی گرید مسی پوشش داده شده با کربن فرم­وار قرار داده شد. پس از خشک شدن، اضافه نمونه با کاغذ صافی گرفته شد. سپس یک قطره از رنگ فسفوتنگستیک‌اسید (01/0 درصد، 4/7-2/7 pH) اضافه گردید و پس از خشک شدن، ساختار فاژ با میکروسکوپ الکترونیTEM  مشاهده شد. تصاویر گرفته شده با فاژهای استاندارد شناسایی شده قبلی موجود در منابع معتبر به منظور تشخیص خانواده آن­ها مطابقت داده شد (16).
ارزیابی کارایی ضدمیکروبی فاژ جداسازی شده در شرایط آزمایشگاهی
ابتدا باکتری­ اشریشیاکلی به­مدت یک شبانه روز در دمای 37 درجه سلسیوس در محیط کشت مایع LB گرم­خانه­گذاری شد. سپس 100 میکرولیتر از باکتری میزبان به 5 میلی­لیتر محیط نیمه جامد LB اضافه و سپس به یک پلیت LB منتقل و 15 دقیقه صبر کرده تا محیط سفت شود. سپس از فاژ رقت­ سریال تهیه کرده و 10 میکرولیتر از محلول فاژ، به سطح باکتری­هایی که فعال شده و در فاز رشد قرار گرفته­اند، اضافه و به­صورت چمنی پخش شدند. پلیت­ها به­مدت یک شبانه‌روز در دمای 37 درجه سلسیوس گرم­خانه­گذاری شدند. سپس با مشاهده پلاک­ها­، به توانایی فاژ در تجزیه کردن باکتری میزبان پی ­برده و با شمارش تعداد پلاک­ها با رابطه 1، تعداد ذرات فاژ در سوسپانسیون مشخص شد (17).
رابطه 1
تعیین تعداد فاژ     =       (PFU/mL) 
    
تعیین دامنه میزبان و اختصاصیت فاژ جداسازی شده
بدین منظور، دامنه فعالیت و عملکرد اختصاصی فاژ جداسازی شده علیه 5 سویه مختلف از باکتری اشریشیاکلی  و نیز باکتری­های سالمونلا انتریکا، یرسینیا انترکولیتیکا و استافیلوکوکوس اورئوس که در قسمت بالا آورده شده­اند، با استفاده از روش سنجش پلاک ارزیابی شد. بدین منظور، نژادهای باکتریایی که در محیط LB براث رشد کردند، در پلیت LB آگار پخش شدند، سپس 10 میکرولیتر از سوسپانسیون فاژ جداسازی شده روی پلیت ریخته و پلیت­ها به­مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس گرم­خانه­گذاری شدند (18).
ارزیابی کارایی فاژ ایزوله شده در کاهش باکتری بیماری­زای اشریشیاکلی در گوشت مرغ
الف- آماده‌سازی نمونه: در این پژوهش از گوشت خام مرغ به­عنوان بستر غذایی برای ارزیابی فعالیت باکتریوفاژ استفاده شد. مرغ خام تازه از فروشگاه­ شهر ملایر تهیه و برای آزمون بررسی شد. برای این کار ابتدا 25 گرم از فیله مرغ برداشته و جهت حذف میکروارگانیسم­هایی که به­طور طبیعی در سطح مرغ حضور داشتند، سطح گوشت­ها با اشعه گاما (KG 10) در سازمان انرژی اتمی ایران استریل شد. سپس در بسته­بندی­های پلی‌اتیلنی بسته­بندی و جهت آزمایشات بعدی در فریزر (20- درجه سلسیوس) نگه­داری شدند. سپس جهت تأیید حذف میکروارگانیسم­ها از سطح فیله مرغ پس از اشعه­دهی، از محیط کشت نوترینت آگار استفاده شد (19).
ب- آزمون غذایی: کشت سه ساعته (2/0 OD600 ≈) باکتری اشریشیاکلی در تمامی آزمایش­ها به­عنوان میزبان استفاده شد. جهت این کار فیله مرغ در 100 میلی­لیتر از سوسپانسیون باکتری با رقت (103CFU/g) غوطه­ور شد و سپس 10 دقیقه اجازه داده شد تا به سطح گوشت منتقل شوند. پس از آن محلول باکتریوفاژ (108CFU/g) به آن اضافه گردید. در تمامی نمونه­ها شمارش کلی باکتری­های زنده بلافاصله پس از افزودن باکتری­ها و فاژها انجام شد. جهت شمارش، نمونه­ها به کیسه­­ی استریل حاوی 225 میلی­لیتر محلول نمکی 85/0 درصد منتقل شدند. سپس نمونه­ها به­مدت 1 دقیقه در استومیکر (مدل W 400- ساخت فرانسه) با دور 200 دور در دقیقه مخلوط و هم زده شدند. بخش مایع به یک لوله استریل سانترفیوژ منتقل شد. سپس 100 میکرولیتر از نمونه در محیط کشت نوترینت آگار به­مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس گرم­خانه­گذاری شدند و کلنی­های مورد نظر شمارش شدند (20).

یافته‌ها

 
جداسازی فاژ و تعیین تعداد ذرات فاژ
فاژ اختصاصی اشریشیاکلی از نمونه فاضلاب به­طور موفقیت­آمیز جداسازی شده که از طریق نواحی لیز شده در محیط کشت قابل مشاهده شده است. پس از خالص­سازی فاژ، آن را روی پلیت حاوی اشریشیاکلی اضافه کریدم. پس از انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی­گراد به­مدت 24 ساعت، فاژ جداسازی شده بر باکتری اثر گذاشت، آن ­را به­خوبی لیز کرد، از بین برد و سبب ایجاد حفره‌هایی در سطح آگار شد (شکل 1). تعداد فاژهای موجود در محلول نیز با استفاده از رابطه (1) از طریق تعداد واحدهای تشکیل­دهنده پلاک در هر میلی­لیتر محاسبه و بین PFU/mL 108 تا 1010 تخمین زده شد.

بررسی مورفولوژی و شناسایی خانواده احتمالی فاژ 

تعیین خصوصیات مورفولوژیکی و شناسایی خانواده فاژ با استفاده از میکروسکوپ الکترونی TEM انجام شد. فاژهای مورد مشاهده از نوع بدون دم و دارای سر یا کپسیدی کروی با اندازه­ای حدوداً 70-60 نانومتر بودند که احتمال می­رود عضوی از خانواده تکتی­ویریده باشند (شکل 2).
 

شکل 2. تصویر گرفته شده توسط میکروسکوپ TEM مربوط به ساختار فاژ لیتیک اشریشیاکلی جداسازی شده
 
تعیین اختصاصیت و طیف میزبانی فاژ
برای بررسی اختصاصیت و طیف میزبانی، فاژ جداسازی شده در معرض 4 جنس باکتریایی مختلف قرار داده شد. نتایج نشان داد که فاژ جداسازی شده بر سایر جنس­های مورد آزمون، هیچ­گونه اثر ضدمیکروبی نداشت (جدول 1). هم­چنین فاژ مورد آزمون را در معرض  6 سویه از باکتری اشریشیاکلی قرار دادیم. نتایج نشان داد از بین 6 سویه انتخابی، فاژ مورد نظر بر 5 سویه­ ، اثر ضدمیکروبی داشته است که دارد؛ این، نشان­دهنده­ وسیع‌الطیف بودن فاژ جداسازی شده است (جدول 2).
در این مطالعه، استفاده از فاژ اختصاصی باکتری اشریشیاکلی (PFU/mL 108) در گوشت مرغ، میزان آلودگی آن را به­طور چشم­گیری کاهش داد. افزودن سوسپانسیون فاژ به گوشت مرغ آلوده شده با باکتری اشریشیاکلی، موجب کاهش باکتری میزبان در 24 ساعت اول پس از تلقیح شد (شکل 3). به­طوری­که جمعیت باکتریایی به اندازه 10log 2/1 کاهش یافته است. روال کاهش باکتری میزبان تقریباً تا 48 ساعت پس از افزودن فاژ با شیب کمتری ادامه داشت و پس از آن تقریباً ثابت شد، به­طوری­که در روز چهارم پس از تلقیح، میزان باکتری اشریشیاکلی تقریباً به کمتر از 1 سیکل لگاریتمی رسید. این­طور به نظر می­رسد که به محض ورود باکتری­ها به محیط غذایی، فاژ به آن­ها متصل شده و در نهایت با تجزیه سلول­های باکتری، جمعیت آن­ها کاهش یافته است. در نتیجه، توانایی قابل توجه فاژ مورد استفاده در این پژوهش در کاهش باکتری اشریشیاکلی، موجب بهبود ایمنی گوشت مرغ شده است.
 
 
 
 
جدول 1. فعالیت فاژ جداسازی شده علیه باکتری­های مختلف
Plaque Bacteria
+ E. coli  PTCC  1330
- Salmonella enterica subsp. Enterica serovar typhimurium ATCC 14028
- Staphylococcus aureus ATCC 2392
- Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica  PTCC  1785
 
 
جدول 2. فعالیت فاژ جداسازی شده علیه سویه­های مختلف اشریشیاکلی
لیز (انهدام) باکتری­های مورد آزمون
+ 1330 E. coli PTCC
+ 25922 E. coli ATCC
- 35218 E. coli ATCC
+ 33876 E. coli ATCC
+ 2197 E. coli DHα5 SCC
+ 5976 E. coli BL21 PTA
+ دارای اثر ضدمیکروبی؛ - بدون اثر ضدمیکروبی
 
 
 
 
ارزیابی کارایی فاژ ایزوله شده در کاهش باکتری بیماری­زای اشریشیاکلی در گوشت مرغ
 
شکل 3. نمودار تأثیر فاژ لیتیک اختصاصی اشریشیاکلی بر میزان آلودگی اشریشیاکلی تلقیح شده در گوشت مرغ

بحث


باکتریوفاژها ویروس­هایی هستند که بر سلول­های پروکاریوت اثر می­گذارند. فاژها نیز همانند سایر گونه­های ویروسی، جهت زنده ماندن به یک سلول میزبان نیاز دارند و از طریق تغذیه از آن سلول، قادر به بقاء و تکثیر می­باشند. تفاوت فاژها در خاصیت انتخابی بودن آن­ها می­باشد، به­گونه­ای که هر فاژ تنها بر باکتری خاصی اثرگذار و بر سایر میکروارگانیسم­ها بی­تأثیر می­باشد. اختصاصی بودن میزبان به­طور کلی در سطح سویه، گونه و یا به­ندرت در سطح جنس می­باشد. فاژها با استفاده از این ویژگی می­توانند باکتری­های مولد فساد مواد غذایی را مورد هدف قرار دهند (21). محققان مختلفی از فاژهای مهاجم، جهت درمان بیماری­های عفونی (Phage therapy)، کنترل باکتری­های بیماری­زای گیاهان و هم­چنین کنترل این باکتری­ها در سطح مزرعه و فرآوری مواد غذایی استفاده کردند (20، 22، 23). مزیت اصلی استفاده از فاژها، توانایی آن­ها جهت تکثیر خود می­باشد که به جهت داشتن این توانایی، می­توانند موجب کنترل مواد غذایی در طی دوره نگه­داری شوند. آماده­سازی فاژها نیز نسبتاً آسان و هم­چنین استفاده از آن­ها مقرون­ به­صرفه می­باشد (24). عملکرد اختصاصی آن­ها نیز از نابودی باکتری­های مفید جلوگیری می­کند. با این­حال استفاده از فرآیندهایی مانند پاستوریزاسیون، نگه­دارنده­های شیمیایی یا آنتی­بیوتیک­ها اجنتاب­ناپذیر است. از آن­جایی­که فاژها برای میزبان باکتریایی خود اختصاصی عمل می­کنند، امکان ایجاد عفونت سلول­های یوکاریوتی توسط فاژها وجود ندارد؛ بنابراین این مسئله مصرف فاژها توسط انسان را ایمن می­سازد (25، 26).
کاربرد فاژها به­عنوان فناوری ضدباکتریایی امیدبخش می­تواند در مهار دامنه وسیعی از باکتری­های بیماری­زا و کاهنده رشد مفید باشد. استفاده از فاژها جهت مهار باکتری­ها به­ویژه پاتوژن­های موجود در زنجیره غذایی توجه زیادی را به­خود جلب کرده است (19). هدف از این مطالعه، جداسازی و تعیین مشخصات فاژ لیتیک اختصاصی علیه باکتری اشریشیاکلی بود.
درباره جداسازی و شناسایی فاژهای موثر بر باکتری اشریشیاکلی، مطالعات متعددی انجام شده است.  Soltan Dallalو همکاران، فاژ اختصاصی اشریشیاکلی را از نمونه فاضلاب خام جداسازی کردند. نتایج آن­ها نشان داد فاژ جداشده به­خوبی قادر به لیز کردن و از بین بردن باکتری اشریشیاکلی بود (18) که با نتیجه این تحقیق مطابقت داشت.
همچنین  Singhو همکاران، اثر ضدمیکروبی فاژ جداسازی شده از نمونه فاضلاب را بر کاهش باکتری­ اشریشیاکلی به­عنوان یک باکتری بیماری­زای غذازاد بررسی کردند. در بررسی آن­ها نیز مانند پژوهش حاضر، پلاک­های شفافی در سطح محیط کشت ظاهر شد که نشان دهنده اثر ضدمیکروبی فاژ جداسازی شده علیه باکتری میزبان بود. اما برخلاف فاژ فاقد دم جداسازی شده در این پژوهش، فاژ جدا شده در پژوهش آن­ها، دارای کپسیدی حدوداً به اندازه 78 نانومتر و دم بلند به­طول 527 نانومتر بود که به راسته کادوویرال و خانواده سیفوویریده تعلق داشت (27). Jann و همکاران نیز، فاژ اختصاصی 8Ω علیه سویه­های اشریشیاکلی را از فاضلاب جداسازی کردند. فاژهای جداسازی شده داری کپسید متقارن به ­قطر 50-48 نانومتر و فیبرهای دمی بلند به­طول 168 نانومتر بودند و اثر ضدمیکروبی قابل توجهی علیه سویه­های اشریشیاکلی داشتند (28). همچنینZare  و همکاران، فاژ لیتیک موثر بر اشریشیاکلی مقاوم به درمان را از فاضلاب جداسازی کردند. فاژ جدا شده متعلق به خانواده سیفوویریده بود و توانست مانند فاژ جداسازی شده این پژوهش، به­طور موثر تمامی سویه­های اشریشیاکلی بیماری­زا جدا شده از زخم بیماران دیابتی را لیز کند (15).
Beheshti Maal و همکاران، فاژهای لیتیک و اختصاصی اشریشیاکلی را از رودخانه زاینده­رود اصفهان جداسازی کردند. کولی­فاژهای جداشده، اثرات ضدمیکروبی مناسبی بر باکتری اشریشیاکلی داشتند. برخی از فاژهای جداسازی شده در پژوهش آن­ها به خانواده میوویریده و برخی دیگر نیز به خانواده پودوویریده متعلق بودند (29). درحالی­که فاژ جدا شده در پژوهش حاضر به­طور احتمالی به خانواده تکتی­ویریده تعلق یافت.
به­طور کلی، تاکنون اکثر فاژهای کشف شده در دنیا از نوع دم­دار بلند یا کوتاه و متعلق به خانواده­های پودوویریده، میوویریده و سیفوویریده بوده‌اند و درباره جداسازی و شناسایی فاژهای بدون دم اطلاعات کمی در دسترس است. Chai و همکاران، فاژ 161φHN را از فاضلاب جداسازی کردند که توانایی بالقوه­ای در از بین بردن باکتری اشریشیاکلی 161O داشت و از لحاظ مورفولوژی فاقد دم بوده و دارای کپسیدی کروی بود که متعلق به­ خانواده تکتی­ویریده بود (30). فاژ جداسازی شده در پژوهش حاضر نیز ازنظر مورفولوژی ارتباط بسیار نزدیکی با فاژ کشف شده توسط این محققان داشت که  احتمالاً آن هم عضوی از خانواده تکتی­ویریده می­باشد. در ارتباط با استفاده از فاژها در کاهش آلودگی مواد غذایی نیز تحقیقاتی  انجام شده که در ادامه به برخی از آن­ها اشاره می­شود.
Hagens  و همکاران، جهت کنترل سالمونلا انتریدیس در بوقلمون، از فاژهای اختصاصی آن استفاده کردند. نتایج نشان داد غلظت­های  PFU/mL 108 و 1010 موجب 70 تا 90 درصد کاهش در جمعیت باکتری سالمونلا انتریدیس شدند (31). در این پژوهش نیز استفاده از غلظت PFU/mL 108 از فاژ اختصاصی اشریشیاکلی موجب کاهش جمعیت باکتریایی گوشت مرغ از  از 10log 3 به کمتر از 1 سیکل لگاریتمی شد.
Hungaro و همکاران، از ترکیب عوامل شیمیایی و فاژها جهت کاهش باکتری سالمونلا انتریتیدیس در پوست مرغ استفاده کردند. نمونه­های پوست مرغ با CFU/cm2 105 از باکتری سالمونلا انتریتیدیس آلوده و با مخلوطی از 5 فاژ لیتیک اختصاصی (PFU/mL 109) و عوامل شیمیایی (مانند سدیم دی‌کلروایسوسیانورات یا پراستیک‌اسید) تیمار شدند. در هر دو تیمار کاهشی حدوداً به اندازه 1 سیکل لگاریتمی در هر سانتی­متر مربع مشاهده شد (19). برخلاف آن­ها، در این پژوهش تنها از یک نوع فاژ لیتیک اختصاصی با غلظت PFU/mL 108 جهت کاهش باکتری اشریشیاکلی تلقیح شده به گوشت مرغ (CFU/mL 103) استفاده شد که نتایجی مشابه به آن­ها به­دست آمد (19).
Fiorentin و همکاران، از فاژهای لیتیک سالمونلا انتریتیدیس (PFU/mL 109) جهت کاهش باکتری سالمونلا انتریتیدیس (CFU/mL  106) تلقیح شده به پوست مرغ استفاده کردند. بر اساس نتایج در نمونه­هایی که در روزهای 3، 6 و 9 پس از کشتار با فاژ تیمار شدند، کاهش قابل توجهی در تعداد باکتری­های سالمونلا مشاهده شد (32). نتایج این تحقیق نیز گواه کاهش قابل توجه جمعیت اشریشاکلی تلقیح شده به گوشت مرغ پس از تیمار با فاژ مورد نظر بود.
 

نتیجه­ گیری

پژوهش حاضر اولین تحقیق بنیادی درباره کاربرد فاژ در کنترل آلودگی اشریشیاکلی در گوشت مرغ در ایران بود. در این پژوهش، فاژ لیتیک اختصاصی اشریشیاکلی جداسازی شده از فاضلاب از نظر مورفولوژی دارای کپسیدی کروی و فاقد دم بود که به­طور احتمالی به خانواده تکتی­ویریده تعلق یافت و دارای اثر ضدمیکروبی قوی بر سویه­های انتخابی باکتری اشریشیاکلی بود، اما بر باکتری­های سالمونلا انتریکا، یرسینیا انترکولیتیکا و استافیلوکوکوس اورئوس اثر ضدمیکروبی نداشت. همچنین میزان باکتری اشرشیاکلی در گوشت مرغ را پس از 24 ساعت از 10log 3 به 10log 8/1 کاهش و پس از 4 روز به کمتر از 1 سیکل لگاریتمی رساند. بنابراین، می­تواند به­عنوان عامل بیوکنترل باکتری اشرشیاکلی در مواد غذایی استفاده شود.
 

سپاسگزاری

این مقاله حاصل رساله دکتری دانشکده صنایع غذایی دانشگاه علوم­کشاورزی و منابع طبیعی گرگان است. بدین­وسیله نویسندگان این مقاله از گروه علوم و مهندسی صنایع غذایی دانشکده صنایع غذایی این دانشگاه و  همچنن گروه زیست­شناسی دانشگاه ملایر بابت حمایت­ها و زحمات فراوانشان کمال تشکر و قدردانی را دارند.

تعارض در منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

نوع مطالعه: مقاله پژوهشی | موضوع مقاله: مواد ضد میکروبی
دریافت: 1398/5/10 | پذیرش: 1398/9/1 | انتشار الکترونیک: 1398/9/1

فهرست منابع
1. Atterbury RJ, Dillon E, Swift C, Connerton PL, Frost JA, Dodd CER, et al. Correlation of Campylobacter bacteriophage with reduced presence of hosts in broiler chicken ceca. Appl Environ Microbiol. 2005; 71(8):4885-7. [DOI:10.1128/AEM.71.8.4885-4887.2005] [PMID] [PMCID]
2. Muth, M K, Fahimi M, Karns SA. Analysis of Salmonella control performance in U.S. young chicken slaughter and pork slaughter establishments. J of Food Protec. 2009; 72(1):6-13. [DOI:10.4315/0362-028X-72.1.6] [PMID]
3. Motarjemi Y, Moy GG, Jooste PJ, Anelich LE. Food Safety Management. In: Motarjemi Y, Lelieveld H (Eds). San Diego: Academic Press; 2014. [DOI:10.1016/B978-0-12-381504-0.00041-X]
4. Hosseini Jazani N, Hadizadeh O, Farzaneh H, Moloudizargari M. Synergistic antibacterial effects of β- Chloro- L- alanine and phosphomycin on urinary tract isolates of E. coli. Bio J Microbiol. 2013; 1(4):1- 6.
5. Hill B, Smythe B, Lindsay D, Shepherd J. Microbiology of raw milk in New Zealand. Int J Food Microbiol. 2012; 157(2):305-308. [DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2012.03.031] [PMID]
6. Kutter E, Sulakvelidze A (Eds). Bacteriophages: Boca Raton: CRC Press; 2005; 1-5. [DOI:10.1201/9780203491751]
7. World Health Organization. The FTY eighth world health assembly. Geneva: WHO; 2005.
8. World Health Organization. Food safety & food-borne illness. fact sheet no. 237 (reviewed March 2007). Geneva: WHO; 2007.
9. Steinbacher S, Baxa U, Miller S, Weintraub A, Seckler R, Huber R. Crystal structure of phage P22 tails pike protein complexed with Salmonella sp. antigen receptors. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; (93):10584-8. [DOI:10.1073/pnas.93.20.10584] [PMID] [PMCID]
10. Kutateladze M, Adamia R. Bacteriophages as potential new therapeutics to replace or supplement antibiotics. Trends Biotechnol. 2010; (28):591-5. [DOI:10.1016/j.tibtech.2010.08.001] [PMID]
11. Scallan E, Hoekstra RM, Angulo FJ, Tauxe RV, Widdowson MA, Roy SL, et al. Foodborne illness acquired in the United States-major pathogens. Emerg Infect Dis. 2011; 17(1):7-15. https://doi.org/10.3201/eid1701.P21101 [DOI:10.3201/eid1701.P11101] [PMID]
12. Pourmahmoodi A, Mohammadi J, Mirzai A, Momeni Negad M, Afshar R. Epidemiological study of traditional ice cream in Yasuj. Armaghan Danesh. 2002; 8(29):59-65. [Persian]
13. Whichard JM, Sriranganathan N, Pierson FW. Suppression of Salmonella growth by wild-type and large-plaque variants of bacteriophage Felix O1 in liquidculture and on chicken frankfurters. J of Food Prot. 2003; (66):220-5. [DOI:10.4315/0362-028X-66.2.220] [PMID]
14. Ranjbar M, Sharifiyan A, Shabani Sh, Amin Afshar M. Antimicrobial effect of garlic extract Staphylococcus aureus and Escherichia coli bacteria in a cook ready chicken to meal model. Food Technol Nutr. 2014; 11(4):57-68.
15. Zare1 L, Shenagari M, Mirzaei MKH, Mojtahedi A. Isolation of lytic phages against pathogenic E.coli isolated from diabtic ulcers. Iran J Med Microbiol. 2018; 11(2):34-41.
16. Borysowski J, Weberdabrowska B, Gorski A. Bacteriophage endolysins as a novel class of antibacterial agents. Exp Biol Med. 2006; (231):366-77. [DOI:10.1177/153537020623100402] [PMID]
17. Vonasek E, Phuong L, Nitin N. Encapsulation of bacteriophages in whey protein films for extended storage and release. Food Hydro. 2014; (37):7-13. [DOI:10.1016/j.foodhyd.2013.09.017]
18. Soltan Dallal MM, Imeni SM, Nikkhahi F, Rajabi Z, Salas SP. Isolation of E. Coli bacteriophage from raw sewage and comparing its antibacterial effect with ceftriaxone antibiotic. Int J Adv Biotechnol Res. 2016; 7(3):385-91.
19. Hungaro HM, Mendonca RCS, Gouvea DM, Vanetti MCD, Pinto CLD. Use of bacteriophages to reduce Salmonella in chicken skin in comparison with chemical agents. Food Res Int. 2013; (52):75-81. [DOI:10.1016/j.foodres.2013.02.032]
20. Anany H, Chen W, Pelton R, Griffiths MW. Biocontrol of Listeria monocytogenes and Escherichia Coli O157: H7 in meat by using phages immobilized on modified cellulose membranes. Appl Environ Microbiol. 2011; (77):6379-87. [DOI:10.1128/AEM.05493-11] [PMID] [PMCID]
21. Hagens S, Loessner MJ. Bacteriophage for biocontrol of foodborne pathogens: calculations and considerations. Current Pharma Biotech. 2010; (11): 58-68. [DOI:10.2174/138920110790725429] [PMID]
22. Hooton S, Atterbury RJ, Connerton IF. Application of a bacteriophage cocktail to reduce Salmonella Typhimurium U288 contamination on pig skin. International Journal of Food Microbiology . 2011; (151): 157-163. [DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2011.08.015] [PMID]
23. Bigwood T, Hudson JA, Billington C. Influence of host and bacteriophage concentrations on the inactivation of food-borne pathogenic bacteria by two phages. FEMS microbiol letters.2009; 291: 59-64. [DOI:10.1111/j.1574-6968.2008.01435.x] [PMID]
24. Greer GG. Bacteriophage control of foodborne bacteria. J of Food Prot. 2005; (68): 1334-1334 [DOI:10.4315/0362-028X-68.5.1102] [PMID]
25. Merabishvili M, Pirnay J, Verbeken G, Chanishvili N, Tediashvili M, Lashkhi N, Glonti T, Krylov V, Mast J, Van Parys L. Quality-controlled small-scale production of a well-defined bacteriophage cocktail for use in human clinical trials. 2009; PloS one 4, e4944. [DOI:10.1371/journal.pone.0004944] [PMID] [PMCID]
26. Carvalho CM, Santos SB, Kropinski AM, Ferreira EC, Azeredo J. Phages as therapeutic tools to control major foodborne pathogens: Campylobacter and Salmonella, In Bacteriophages. 2012. Croatia: InTech, pp 179-214.
27. Singh V, Jain P, Dahiya S. Isolation and characterization of bacteriophage from waste water against E.coli, a food born pathogen. Microbiol Biotech. 2016; (1):163-70.
28. Jann K, Schmidt G, Wallenfels B. Isolation and Characterization of Escherichia coli bacteriophage Ω 8 specific for E. coli strains belonging to sero-group Ω 8. General Microbiol. 1971; (67):289-97. [DOI:10.1099/00221287-67-3-289] [PMID]
29. Beheshti Maal K, Soleimani Delfan A, Salmanizadeh SH. Isolation and identification of two novel Escherichia Coli bacteriophages and their application in wastewater treatment and coliform's phage therapy. Jundishapur J Microbiol. 2015; 8(3):e14945. [DOI:10.5812/jjm.14945] [PMID] [PMCID]
30. Chai Q, Dandan W, Liu F, Song F, Tang X, Cao Y, et al. Therapy potential of tailless bacteriophage ΦHN161 and its ability in modulating inflammation caused by bacterial disease. Vet Med Open. 2016; 1(2):36-42. 31. [DOI:10.17140/VMOJ-1-107]
31. Hagens S, Loessner MJ. Bacteriophage for biocontrol of foodborne pathogens: calculations and considerations. Curr Pharm Biotechnol. 2010; (11):58-68. [DOI:10.2174/138920110790725429] [PMID]
32. FiorentinL, Vieira ND, Barioni Junior W. Use of lytic bacteriophages to reduce Salmonella Enteritidis in Experimentally Contaminated Chicken Cuts. Br J Poultry Sci. 2005; 7(4):255-60. [DOI:10.1590/S1516-635X2005000400010]

ارسال نظر درباره این مقاله : نام کاربری یا پست الکترونیک شما:
CAPTCHA

ارسال پیام به نویسنده مسئول


بازنشر اطلاعات
Creative Commons License این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است.

کلیه حقوق این وب سایت متعلق به مجله میکروب شناسی پزشکی ایران می باشد.

طراحی و برنامه نویسی : یکتاوب افزار شرق   ناشر: موسسه فرنام

© 2024 CC BY-NC 4.0 | Iranian Journal of Medical Microbiology

Designed & Developed by : Yektaweb Publishr: Farname Inc.